Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

doi: 10.3791/3636 Published: January 25, 2012

Summary

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Abstract

Mengen is een eenheid bewerking die twee of meer componenten samengevoegd tot een homogeen mengsel. Dit werk omvat het mengen van twee viskeuze vloeistof stromen met een in-lijn statische mixer. De mixer is een split-en recombineren-ontwerp dat afschuiving en uitbreidende stroming dienst toenemen het grensvlakcontact tussen de componenten. Een prototype split-and-recombineren (SAR) mixer werd geconstrueerd door het uitlijnen van een reeks dunne laser gesneden Poly (methylmethacrylaat) (PMMA) platen in plaats die in een PVC pijp. Mengen in deze inrichting wordt geïllustreerd in de foto in Fig. 1. Rode kleurstof toegevoegd aan een deel van de testvloeistof en gebruikt als de kleine component te mengen in de major (ongeverfde) component. Bij de inlaat van de mixer wordt de geïnjecteerde laag tracer vloeistof gesplitst in twee lagen terwijl het door de mengsectie. Elk volgend mengsectie wordt het aantal horizontale lagen gedupliceerd. Uiteindelijk wordt de enkele stroom van kleurstof gelijkmatig gedispergeerd throughout de dwarsdoorsnede van de inrichting.

Een niet-Newtonse testvloeistof van 0,2% Carbopol en gedoteerde tracer vloeistof van vergelijkbare samenstelling, mengen in het apparaat gevisualiseerd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming (MRI). MRI is een zeer krachtige experimentele sonde van moleculaire chemische en fysische milieu en steekproef structuur op de lengteschalen van microns tot centimeters. Deze gevoeligheid heeft geresulteerd in brede toepassing van deze technieken fysische, chemische en / of biologische eigenschappen van materialen, variërend van mensen aan levensmiddelen poreuze media 1, 2 karakteriseren. De apparatuur en omstandigheden die hier geschikt zijn voor imaging vloeistoffen die aanzienlijke hoeveelheden NMR mobiele 1H zoals gewoon water en organische vloeistoffen zoals oliën. Traditioneel MRI heeft gebruikt supergeleidende magneten die niet geschikt zijn voor industriële omgevingen en niet draagbaar binnen een laboratorium (afb. 2). Recente ontwikkelingen in magneet technologie hebben toegestaan ​​de bouw van een groot volume industrieel compatibel magneten geschikt voor beeldvorming processtromen. Hier MRI geeft ruimtelijk opgeloste component concentraties op verschillende axiale plaatsen tijdens het mengproces. Dit werk documenten real-time het mengen van hoog viskeuze vloeistoffen via distributieve menging met een aanvraag om producten voor persoonlijke verzorging.

Protocol

1. Voorbereiding van lage-fouling achtergrond

  1. Weeg 2 g van poly (hydroxyethylmethacrylaat) (PHEMA) (Sigma - celkweek getest) in een 50 ml centrifugebuis. Lossen in 50 ml 95% (v / v) ethanol in water. Dit duurt gewoonlijk 24 uur van ultrasoonapparaat.
  2. Dip-coat epoxy-functionele glasplaatje (Genetix) met de pHEMA oplossing. De epoxygroepen zal snel vormen covalente bindingen met de pHEMA coating. Dip-coating wordt bereikt door het objectglaasje met een pincet en de dia dompelen in de oplossing. Typisch 5 mm van de schuif blijft onbekleed, die bruikbaar is voor richten van de slede en kan ook fungeren als positieve controle als hechtende ondergrond. De slede wordt vervolgens uit de pHEMA oplossing over een periode van 1 s, omgekeerd en gedroogd in een nagenoeg horizontale positie 10 min alvorens in een houder.
  3. De pHEMA gecoate glaasjes worden vervolgens linksaf bij atmosferische omstandigheden voor 1 week om de volledige verdamping van t makenhij oplosmiddel.

2. Bereiding van monomeeroplossing

  1. Weeg 120 mg van de fotoinitiator 2,2-dimethoxy-2-fenylacetofenon en aan 3 ml dimethylformamide (DMF) een 4% (w / v) fotoinitiator oplossing. Dit wordt best vers gedaan elke oplage, zodat de massa en het volume van de oplossing die kan worden gevarieerd om te passen hoeveelheid initiator oplossing nodig. De oplossing is stabiel tot een maand.
  2. Monomeeroplossingen worden gemaakt door toevoeging van 1 deel van de fotoinitiator oplossing en 3 delen de nette monomeer. Dit wordt bereikt door pipetteren 5 ui fotoinitiator oplossing en 15 pi van monomeer in een 384 putjes plaat bron. Een totaal volume van 20 ul ideaal voor vlekvorming. Hogere volumes extra blotting voor uniforme plekken kunnen worden geproduceerd. Kleinere volumes kunnen onvolledige belasting van de pen.
  3. Deze methode is momenteel beperkt tot het gebruik van acrylaat / methacrylaat monomeren die oplosbaar zijn in DMF door virtue deze de enige combinaties die zijn onderzocht, acrylamiden en andere oplosmiddelen waarschijnlijk ontvankelijk voor het drukproces. Ter verwezenlijking van de monomeerconcentratie voorgesteld (75% w / w) vloeibare monomeren zijn ook vereist, hoewel lagere monomeerconcentraties kan worden gebruikt voor vaste monomeren (het verlaagde monomeerconcentratie lijkt evenwel nadelig te veranderen de oppervlaktechemie van het resulterende polymeer is waarschijnlijk dat het molecuulgewicht en glasovergangstemperatuur wordt gewijzigd). Zeer vluchtige monomeren zijn ook moeilijk te gebruiken voorafgaand door de snelle verdamping van monomeer tot het UV hardingsstap bij polymeriseren. Afhankelijk van het aantal monomeeroplossingen een run kan maximaal 6 uur en aan het eind van de run vluchtige monomeren nemen verdampt zijn van de bron plaat. Gebruik van vluchtige monomeren kan worden bereikt door het koelen van de drukfase en met kleinere oplagen alleen.
  4. Met uitzondering van enkele zeer hydrofiele monomerenzoals poly (ethyleenglycol) acrylaat, de ontbinding van het verkregen polymeer spots in waterige buffers niet waargenomen, dus is het gebruik van een verknopend monomeer niet nodig, hoewel niet uitgesloten.

3. Polymer microarray vorming

De typische procedure voor polymeer microarray vorming is schematisch weergegeven in figuur 1.

  1. Microarray vorming wordt bereikt door een contact robot (Biodot) met een XYZ fase (figuur 2). Slotted pinnen van 220 micrometer diameter worden gebruikt (Arrayit 96B). Alle kunnen worden gereinigd door sonicatie in dichloormethaan gedurende 10 minuten voorafgaand aan de oplage en ook de penhouder moet worden gereinigd.
  2. Kunnen worden geladen in de houder, blotting en matrix slides worden geladen en vervolgens de gehele kamer is gevuld met argon om het zuurstofgehalte tot minder dan 2000 ppm, die voldoende laag aan afschrikken van de polymerisatie radicalen voorkomen door zuurstof. De luchtvochtigheid wordt gehad op tussen 30-40%. Waaronder vochtigheid maakt de pHEMA zwellen waardoor het gevormde polymeer de pHEMA laag doordringen en fysiek ingesloten aan het oppervlak 2 worden.
  3. De oplage wordt begonnen. Elke run bestaat uit:
    • Laden monster uit de bron plaat. De pennen worden neergelaten in de oplossingen met een snelheid van 25 mm / s gehouden in oplossing gedurende 2,5 s en vervolgens onttrokken met een snelheid van 25 mm / s (Figuur 2).
    • Kunnen worden uitgewist voor afdrukken op monomeeroplossing uit de buitenkant van de pen. Vervolgens monomeer levering plaatsvindt van de quilled van de pen consistente vlekvorming. De gebruikte blotting volgorde bestaat uit 33 contacten met een schoon glasplaatje. Voor de eerste vier posities van het aantal gemaakte contacten 10, 5, 4 en 3. De volgende vier posities 2 contacten zijn gemaakt en in de laatste 3 posities 1 contact wordt gemaakt. Totale contacttijd voor elk contact is 10 ms en aanpak en de intrekking snelheid is 175mm / s. Op dit punt gevormde spots moeten een consistente vorm en geometrie. Het niet op dit punt geeft onreine pinnen of stof verontreiniging in het monomeer oplossingen.
    • Het monomeer oplossingen worden vervolgens afgedrukt op het pHEMA beklede objectglaasjes (figuur 2). Een contact wordt per spot op pin beweging van 175 mm / s en contacttijd van 10 ms, die afhankelijk van de viscositeit en oppervlakte-energie van de monomeeroplossing geeft een gemiddelde spot diameter van 400 urn. Typisch 3 herhaalde arrays worden afgedrukt op elk glasschijfje en een totaal 10 slides worden op een enkele run. Dit komt overeen met 30 spots per cyclus.
    • Kunnen worden gewassen in DMF. 2,5 L van vers DMF wordt voor de gehele run was. Kunnen worden gewassen in een stroom bad met agitatie.
    • Gelijktijdig met het wassen worden de recent bedrukt dia bestraald met een korte golf UV (365 nm) bron met een dichtheid van 30 mV / cm 2 voor de duur van de periode was 30 s duurt.
  4. Eenfter alle monomeeroplossingen afgedrukt de arrays bestraald met UV (365 nm) gedurende nog eens 10 min.
  5. De vers gedrukte arrays worden gehouden bij lage druk (<50 mTorr) gedurende 1 week gepolymeriseerd monomeer en oplosmiddel te verwijderen.

4. Hoge doorvoer oppervlakte karakterisering (HTSC)

Een opzet van het HTSC technieken is weergegeven in figuur 3. Centraal in de geautomatiseerde high throughput benadering is de uitlijning van het polymeer microarray de karakterisatie inrichting. In alle gevallen wordt dit bereikt met een camera die een bovenaanzicht van de array geeft. Aanvankelijk de array geroteerd te lijnen met de XY beweging van het podium. Een hoek spot van de array geplaatste en specifieke coördinaten. De positie van elk polymeer spot kan dan worden voorspeld met behulp van de afmetingen van de array.

  1. Watercontacthoek (WCA) metingen
    1. WCA metingen worden uitgevoerd met behulp van de sessiele druppel methode op eengeautomatiseerde Krüss DSA 100 instrument. Een druppel water met een volume van ~ 400 pL wordt aangebracht met een piezo-aangedreven printkop op elk polymeer spot. De diameter van een polymeer spot is typisch 300 urn diameter en de basis van de waterdruppel op het polymeer spot is typisch 100 urn dus slechts een meting kan worden verkregen polymeer per spot.
    2. Een kruistafel maakt de automatische positionering van elk polymeer spot onder de printkop 7. Dit wordt bereikt met een camera boven het monster dat een bovenaanzicht van de array geeft. Aanvankelijk moet de camerapositie worden aangepast aan de afgifte van de waterdruppel te centreren van het camerabeeld en de array kan worden aangepast aan de printkop.
    3. Een hoge snelheid camera registreert het zijprofiel van de druppel op het raken van het oppervlak en vervolgens verdampen. Het frame dat het initiële effect van daling vangt wordt gebruikt om de contacthoek te meten. Een cirkel is bevestigd aan de daling profile en de contacthoek vervolgens bepaald.
  2. Time-of-Flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS)
    1. Monster geladen fase. Het gaat in de eerste plaats langs het podium met schoon Al folie, die helpt met extra betaling schadevergoeding, dan houdt de schuif op zijn plaats door het gebruik van metalen schroef tabbladen.
    2. Monstertafel is geplaatst in de overdrachtskamer van de ToF-SIMS en toegestaan ​​af te pompen tot 1,6 x 10 -6 mbar. Het monster wordt dan overgebracht naar de hoofdanalyse kamer, dat typisch een vacuüm van 1,0 x 10 -8 mbar.
    3. ToF-SIMS metingen worden uitgevoerd met een ION-ToF IV instrument uitgevoerd met een monoisotoop Bi3 + primaire ionen bron bedreven bij 25 kV in "gebundeld mode". Een gepulste 1 pA primaire ionen bundel wordt gerasterd tijdens de onderzochte gebied, met zowel positieve als negatieve secundaire ionen vanuit een 100 x 100 urn gebied van elk polymeer plek in de microarray voor een 10-sectweede acquisitie tijd. Ion massa's werden bepaald met behulp van een hoge resolutie Time-of-Flight analyser waardoor accurate massa opdracht. De typische massa resolutie (bij m / z 41) was net iets meer dan 6000. Lage energie elektronen (20 eV) werden gebruikt om te compenseren voor oppervlakte lading veroorzaakt door de positief geladen primaire ionen bundel op de isolerende oppervlakken 8.
  3. Atomic force microscopie (AFM)
    1. Een groot podium AFM met een automatische fase nodig voor het analyseren van arrays op het glaasje. Een dimensie of ICON microscoop is ideaal voor dit doel.
    2. Monster wordt geplaatst op het podium en het podium positie wordt geadopteerd om rechter bovenhoek van de array.
    3. De positie van de linker onderhoek van de array gevonden, waarmee de positie van alle andere plaatsen te interpoleren.
    4. Een positie lijst wordt gegenereerd en toegevoerd aan de auto-sampling van de software.
    5. AFM metingen worden genomen met behulp van een NanoScope 3000A instrument in te tikken mode. Silicon tips met een resonante frequentie van ongeveer 300 kHz en een krachtconstante 40 N / m gebruikt (Tap300Al, Budget Sensors). 5x5 urn gebieden van het polymeer gemeten 9.
    6. De root mean square (RMS) ruwheid wordt gemeten over deze regio voor elk beeld met behulp van SPIP batch-verwerking software. Elk beeld wordt in eerste instantie voorafgaand aan de meting van de ruwheid afgevlakt.
    7. Alle beelden hebben een handleiding bekijken om beeldvorming artefacten die mogelijk moeten worden verwijderd uit ruwheidsmetingen identificeren. Tijdens deze stap beelden kunnen ook worden ingedeeld gebaseerd op algemene oppervlaktekenmerken 9.
  4. X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS)
    1. Een microarray dia wordt aangebracht op een monster bar met behulp van dubbelzijdige tape en vervolgens geladen in de monsterkamer van een Kratos Axis Ultra XPS instrument.
    2. Voer in de monsterkamer en wacht tot het bereiken van een druk van minder dan 10 -8 Torr.
    3. De juiste werkingparameters, zoals monochromated röntgenbron (Al, 1486,6 eV), anodepotentiaal en stroom (10kV en 15mA), apertuuromvang (110μm), pas energie (80 eV voor brede scan en 20 eV voor hoge resolutie scan) zijn geselecteerd. De röntgenbron gericht met behulp van twee tegenovergestelde hoeken van de microarray en het optimaliseren van de zuurstof signaal van het monster. De x-en y posities van individuele spots wordt bepaald en geregistreerd als een functie lijst.
    4. Een programma grafiek is geschreven en voer voor de verwerving van gegevens, met inbegrip van grote scans en scans met hoge resolutie voor specifieke elementen.
  5. Raman spectroscopie
    1. Raman spectra worden genomen voor elk polymeer plaatse middels een Raman microscoop LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon). Eerst wordt het Raman-signaal gekalibreerd met een silicium wafer en de Raman shift van Si op 520,7 cm -1.
    2. Het monster wordt vervolgens geplaatst op het podium en de focus van de laser (golflengte = 523 nm) wordt aangepast aan de CH Raman shift maximaliserenop 2950 cm -1.
    3. De positie van het midden van de linker vlek op de microarray wordt ingesteld als de oorsprong en een kaart van de microarray is ingesteld met behulp van de array-functie op de labRAM HR-software.
    4. 10 spectra cumulatief gemeten voor elk monster met een belichtingstijd van 0,5 s.

5. Bacteriële test

De array kan worden blootgesteld aan verschillende biologische assays zoals hechting en proliferatie van stamcellen, andere types cellen en bacteriën 3,10,4. Hier beschrijven we een bacteriële aanhechting test, die schematisch is weergegeven in figuur 4.

  1. Een bacteriële stam getransformeerd met GFP expressie plasmide wordt een nacht bij 37 ° C in 10 ml LB media in een 50 ml falcon-buis onder schudden bij 200 rpm.
  2. De OD 600 van de bacteriekweek wordt gemeten en voldoende overnachtcultuur geïnoculeerd in 15 ml RPMI-1640 gedefinieerde media leidenin een uiteindelijke OD600 van 0,01.
  3. Arrays zijn voorwas ondergaan gesteriliseerd gedestilleerd water gedurende 10 minuten aan een oplosbare componenten te verwijderen uit de arrays (unpolymerised monomeer, oligomeren en oplosmiddel)
  4. Gewassen matrix glaasjes in een schone petrischaal en UV gesteriliseerd gedurende 10 minuten.
  5. Een dia met de array geplaatst in een petrischaal en 15 ml geënte RMPI-1640 media toegevoegd. Tegelijkertijd een dia geplaatst in een petrischaal en geïncubeerd met non-innoculatd RPMI-1640 als controle.
  6. Slides worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 72 uur onder schudden bij 60 rpm.
  7. Glaasjes tweemaal gewassen met 15 ml steriel PBS.
  8. Glaasjes tweemaal gewassen met 15 ml steriel gedestilleerd water.
  9. Slides zijn lucht gedroogd.
  10. Glaasjes afgebeeld met een GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, USA) met 488 nm excitatie en standaard blauwe laser emissiefilter (510-560nm). Een vertegenwoordiger polymeer autofluorescentie beeld isgetoond in figuur 2. Dit dient zo snel mogelijk aan het verval van de GFP voorkomen. Als dit niet mogelijk is de cellen te ondergaan fixatie. Bovendien is de opname van passende positieve controles met bekende bacteriële respons noodzakelijk kunnen de resultaten te normaliseren en proeven op verschillende dagen kwantitatief vergelijkbaar mogelijk. De totale fluorescentie-intensiteit van polymeer wordt verkregen met spots GenePix Pro 6 software (Molecular Devices, VS). Dit wordt zowel dia geïncubeerd met bacteriën en slechts media. De fluorescentie door de groei van bacteriën vinden de fluorescentie op het medium controle wordt afgetrokken van de fluorescentie gemeten op de dia geïncubeerd met bacteriën.
  11. Dia's kunnen ook worden gekleurd door 20 uM SYTO17 nucleïnezuur kleurstof (Invitrogen, UK) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en afgebeeld met een Carl Zeiss LSM 700 laser scanning microscoop met ZEN 2009 imaging software (Carl Zeiss, Duitsland). De dekking van bacteriënop het oppervlak wordt bepaald met behulp van open source Afbeelding J 1,44 software (National Institute of Health, VS).

6. Representatieve resultaten

De voorwaarden van de boekdrukkunst zijn geoptimaliseerd om de hoogste kwaliteit polymeer microarrays af te drukken. De vochtigheidsgraad worden gehouden tussen 30-40%. De delaminatie van polymeer spots in waterige milieus werd vaak waargenomen voor arrays gedrukt bij een vochtigheid lager dan 30%, wat suggereert dat deze vochtigheid is onvoldoende om de laag pHEMA zwellen en voor de fysieke insluiting van het polymeer aan het substraat toe. De luchtvochtigheid kan verder worden verhoogd om de diameter van het polymeer spots veranderen, maar dit is afhankelijk van het monomeer chemie. Bijvoorbeeld, waar gelijke volumes van polymerisatieoplossing gedrukt en de vochtigheid werd verhoogd van 40 tot 80% vlekdiameter daalde van 430 urn tot 370 urn voor een monomeer met een hydrofiele ethyleenglycol eenheid gelijk volume terwijl voor een monomer met een hydrofobe alifatische carbon ringstructuur plaatse diameter nam toe van 290 urn tot 350 urn (figuur 5).

De polymerisatiegraad kan worden gecontroleerd met behulp van Raman spectroscopie de C = C Raman shift die wordt gedetecteerd bij 1640 cm -1, die worden genormaliseerd met de C = O Raman shift bij 1720 cm-1 te meten. De Raman spectra werd gemeten polymeer spots gepolymeriseerd verschillende UV blootstelling (Figuur 6). De C = C: C = O daalde als UV blootstelling verhoogd van 0 tot 50 s, waarna geen verdere daling van de C = C: C = O verhouding werd waargenomen met andere UV bestraling (figuur 6). Raman spectra werden gemeten polymeer spots gepolymeriseerd bij gevarieerd O 2 niveau en de C = C Raman shift werd waargenomen als de O 2 level werd verlaagd tot 2000 ppm, evenwel geen verdere vermindering werd waargenomen voor een O 2 niveau daaronder (figuur 7A ). Raman spectroscopie ook werd aangetoond dat het vacuüm extractie step om niet-gepolymeriseerde monomeer te verwijderen. Voorafgaand aan afzuiging de C = C Raman shift was groter voor het polymeer gepolymeriseerd bij 3300 ppm ten opzichte van 2000 ppm (Figuur 7A), maar na vacuümextractie de hoogte van het Raman shift onderscheiden is (Figuur 7B), suggereert alle monomeer gepolymeriseerd is verwijderd tijdens de extractiestap vacuum. Samenvattend polymerisatieomstandigheden omvatten een luchtvochtigheid van 30-40%, UV blootstelling meer dan 50 s bij een O 2 niveau onder 2000 ppm met een afzuiginstallatie stap na het afdrukken gedurende 7 dagen.

Na het afdrukken en vacuüm extractie van het succes van de polymerisatie van polymeer plekken kan worden beoordeeld door een eenvoudige lichtmicroscoop te identificeren en afwijkende plek morfologie. Gewoonlijk moet vlekken rond en uniform, zoals in figuur 8 aan de linkerkant. De waarschijnlijke oorzaak voor een verandering in de geometrie is een beschadigd of onrein pin. Voor een klein aantal monomeer combinaties we hebben waargenomen misvormde spots voor eXample een centrale plek met een satelliet van kleine spots, getoond in figuur 8 rechts of spiegelei vorm waarbij een centrale plek boven op grote spot vlakker. Dit kan worden veroorzaakt door fasescheiding uit te drukken met betrekking tot verschillen in viscositeit, hydrofiliciteit, volatiliteit of oppervlaktespanning van de monomeren en suggereert dat het monomeer combinatie niet compatibel is met dit formaat. Aanvullende chemische mapping polymeer spots met technieken zoals ToF-SIMS is een belangrijke en soms noodzakelijk kwaliteitscontrole stap om de verdeling van de materialen "chemie in de spots en de matrix te bepalen. Deze techniek kan identificeren overmatige verspreiding van sommige materialen onzichtbaar door lichtmicroscopie en identificeren fasescheiding binnen afzonderlijke spots polymeer.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van de verschillende stadia van de vorming van een polymer plek.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische voorstelling van de methode van pin druktechnieken waarbij aanvankelijk laden van de pen met monomeer in een bron plaat vervolgens afzetten van het monomeer op een substraat door contact. De pen wordt door een XYZ robotarm. De inzet toont een typisch beeld van de autofluorescentie van een array na productie.

Figuur 3
Figuur 3. Schematische wijzen bijbehorende techniek HTSC en bioassays toegepast op de studie van polymeer microarrays.

Figuur 4
Figuur 4. Schema van de bacteriële hechting analyse.

Figuur 5
Figuur 5. Polymer stipdoorsnede afgedrukt gevarieerd vochtigheid voor twee verschillende monomeren: 4-tert-butylcyclohexylacrylaat en di (ethyleenglycol) ethyl ether methacrylaat.

Figuur 6
Figuur 6. De verhouding van de intensiteit van het Raman C = C Raman shift bij 1640 cm-1 en de C = O Raman shift bij 1720 cm -1 vanaf polymeer spots van 4-tert-butylcyclohexylacrylaat met verschillende UV blootstelling. De foutstaven gelijk een standaarddeviatie (n = 3).

Figuur 7
Figuur 7. Raman spectra gemeten polymeer spots van 4-tert-butylcyclohexylacrylaat afgedrukt O 2 verschillende niveaus aangegeven aan de linkerkant van elk spectrum (A) vóór en (B) na afzuiginstallatie. De verhouding van de intensiteit van het Raman C = C Raman shift bij 1640 cm-1 en de C = O Raman shift bij 1720 cm -1

Figuur 8
Figuur 8. Een lichte microscopie afbeelding van twee polymeer vlekken. De spot links toont een goed gevormde spot, terwijl de spot rechts is een voorbeeld van een spot met een zeer ongelijkmatig verdeling van monomeer. De schaalstaaf is 500 pm.

Discussion

Polymer microarrays zijn met succes gebruikt voor de ontdekking van nieuwe materialen door screening honderden nieuwe polymeer in een biologische proef en het identificeren treffer materialen die later kunnen worden opgeschaald om nuttige inrichtingen. In dit geval kan de beschreven oppervlaktekarakterisering worden toegepast na de biologische assay en uitsluitend de "hit" materialen die materialen verder te bestuderen. Deze strategie kan van belang zijn als HTSC is niet beschikbaar voor de experimentator gebruik deze aanpak. Echter, om volledig gebruik polymeer microarrays te bestuderen biologisch-materiaal interacties de volledige reeks honderden materialen worden geanalyseerd voor biologische assays met HTSC methoden, die vervolgens kunnen worden gebruikt om algemene structuur-functie trends observeren.

Contact afdrukken is de metalen pin schuiven op en neer vrij binnen de penhouder. Pin en penhouder netheid van het grootste belang is ervoor te zorgen pFDRUKKEN optreedt succes en strikt moeten worden ondernomen. Voor het begin van een drukkerij de juiste beweging van de pen te voeren binnen de penhouder kan worden getest door het uitvoeren van een test, zonder monomeren aanwezig zijn. Het reinigen moet worden voortgezet totdat de pen beweging wordt reproduceerbaar bereikt.

Nagedacht moet gaan in het ontwerp van het monomeermengsel. Om eenvoudig een combinatoriële bibliotheek van polymeren te produceren, zijn honderden copolymeren gevormd door mengen van een paar monomeren in verschillende verhoudingen. Typisch produceren wij 576 lid bibliotheken vormt dit een 24 x 24 matrix, die geschikt is voor de geometrie van een glasplaatje. Om een ​​combinatoriële bibliotheek die de meeste combinatorische ruimte de eenvoudigste methode is het mengen van 24 monomeren paarsgewijs in een 2:1 verhouding verkent produceren. Ook de opname van samenstelling gradiënten binnen de matrix zijn bruikbaar voor waarvan de waarnemingen van trends, waardoor optimale monomeersamenstellingen om determined. Als voorbeeld van deze 22 monomeren worden gebruikt als de eerste component in een co-monomeer mengsel dat sequentieel wordt verdund met 1 of 6 tweede componenten. Als 5 verdunningen worden gebruikt, bijvoorbeeld de eerste en tweede componenten bij verhoudingen van 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 en 10:90 mengen, zou dit resulteren in 488 unieke copolymeeroplossingen. De totale brengen tot 576, replicaten van de homopolymeren van de gebruikte monomeren worden ingebracht, die vaak een belangrijke referentiemonster. 576 monomeer oplossingen moeten worden afgegeven in 2 384 wells platen. Programmeren van de robot is het makkelijker om twee identieke platen in termen van de positie van de monomeren, waardoor het monomeer oplossing wordt gelijkmatig verdeeld tussen de twee platen.

Een aanzienlijke hoeveelheid tijd kan worden opgeslagen in de bereiding van de bron platen met behulp van multichannel pipetten en het ontwerp van bron platen moeten worden vastgesteld om het gebruik van multichannel pipetten benutten. </ P>

Om geautomatiseerde HTSC van de arrays te bereiken de contante positie moet succesvol worden afgestemd op de karakterisering apparaat. Typisch de toonhoogte van een acrylaat matrix is ​​500-1000 pm en het polymeer spot diameter 300 pm. De meeste XY fasen een resolutie van minder dan 10 micrometer, zodat er voldoende tolerantie voor het oppervlaktekarakterisering inrichting betrouwbaar toegang tot de arrayposities zodra de juiste afmetingen zijn ingevoerd om het monster positionering software. De beperkte automatische positionering in feite de nauwkeurige afdrukken van de array. Om nauwkeurige afdrukken waarborgen is het belangrijk om beweging van het substraat te voorkomen op de drukfase ofwel met afzuiging of veerklemmen met passende afmetingen slide (Merk op dat zowel de Amerikaanse en Europese standaard diaformaat bestaan).

ToF-SIMS is een bijzonder oppervlak gevoelige techniek die elke vorm van verontreiniging van monsters zal nemen. Zo moet grootste zorg wordenom contact met het oppervlak. Monsters mag alleen worden gebruikt, maar het oppervlak plaats geen contact met met schone handschoenen (bij voorkeur polyethyleen) en vers gereinigd pincet. We meestal wassen met chloroform en hexaan. Monsteropslag voor metingen het best in een monsterhouder de dia gescheiden houdt, bijvoorbeeld de 5 houder of 20 houder.

De arrays zijn speciaal ontworpen om compatibel met veel biologische assay formats en uitlezingen, namelijk het gebruikte substraat een microscoopglaasje ideaal voor fluorescentie scanners en lichtmicroscopen. Dit betekent dat het formaat is zeer geschikt voor het verkennen van veel materiaal-biologische interacties. Bovendien kunnen het formaat honderden materialen worden gescreend in parallel. Hierdoor kunnen veel meer materialen worden gescreend dan conventionele methoden waarbij elke nieuwe materiaalchemie individueel wordt afgeschermd. De toegenomen ruimte voor biologisch-materiaal interacties mogelijks voor de opheldering van de mechanismen van biologische oppervlakte interacties, en om de optimale materiaal voor een bepaalde toepassing.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiering van de Wellcome Trust is vriendelijk erkend (licentienummer 085245/Z/08/Z). Nottingham Nanotechnologie en nanowetenschap Centre is vriendelijk bedankt voor het geven van toegang tot het Raman systeem en voor de East Midlands Development Agency voor de financiering van deze apparatuur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epoxy slides Genetix K2652
Contact printer Biodot XYZ3060 Platform
Metal pin ArrayIt 946MP6B
ToF-SIMS instrument ION-TOF
XPS instrument Kratos Analytical
WCA apparatus Krüss DSA 100
AFM Bruker Corporation Dimension Icon
RPMI-1640 cell culture media Sigma-Aldrich R0883
SYTO17 Invitrogen S-7579

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. High throughput methods applied in biomaterial development and discovery. Biomaterials. 31, 187-198 (2010).
  2. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).
  3. Mei, Y., Saha, K., Bogatyrev, S. R., Yang, J., Hook, A. L., Kalcioglu, Z. I., Cho, S. W., Mitalipova, M., Pyzocha, N., Rojas, F., Van Vliet, K. J., Davies, M. C., Alexander, M. R., Langer, R., Jaenisch, R., Anderson, D. G. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nature Materials. 9, 768-778 (2010).
  4. Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).
  5. Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays. Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).
  6. Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. High throughput surface characterisation of a combinatorial material library. Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).
  7. Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. Picoliter water contact angle measurement on polymers. Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).
  8. Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability. Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).
  9. Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. Acrylate polymers with hydro-responsive topography. Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).
  10. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (2008).
Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).More

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter