Nivel de especies reactivas del oxígeno se eleva cuando las células encuentran condiciones de estrés. Aquí se muestra el ejemplo de la tinción Diaminobencidina 3'-3 ', así como el etiquetado cysTMT y espectrometría de masas para perfilar el proteoma redox en<em> Pseudomonas syringae</em> Tratar las hojas de tomate.
Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 cepa no sólo causa la enfermedad mancha bacteriana en Solanum lycopersicum sino también en especies de Brassica, así como en Arabidopsis thaliana, una planta huésped genéticamente 1,2 tratable. La acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cotiledones inoculados con DC3000 indica un papel de ROS en la modulación de la muerte celular necrótica durante la enfermedad mancha bacteriana del tomate 3. El peróxido de hidrógeno, un componente de ROS, se produce después de la inoculación de las plantas de tomate con Pseudomonas 3. El peróxido de hidrógeno puede ser detectado mediante una tinción histoquímica 3'-3 'diaminobenzidina (DAB) 4. Tinción DAB reacciona con el peróxido de hidrógeno para producir una mancha marrón en el tejido de la hoja 4. ROS tiene un papel regulador del medio ambiente redox celular, que puede cambiar el estado redox de ciertas proteínas 5. La cisteína es un aminoácido importante sensible acambios redox. Bajo la oxidación leve, la oxidación reversible de los grupos sulfhidrilo de cisteína sirve como sensores y transductores de señal redox que regulan una variedad de procesos fisiológicos 6,7. De masas en tándem de etiquetas (TMT) los reactivos permite la identificación simultánea y multiplexado de la cuantificación de proteínas en diferentes muestras mediante espectrometría de masas 8,9. Los reactivos de cisteína-TMT (cysTMT) reactivos habilitar etiquetado selectiva y cuantificación relativa de cisteína que contiene péptidos de hasta seis muestras biológicas. Cada etiqueta cysTMT isobárica tiene la misma masa padre nominal y se compone de un grupo sulfhidrilo-reactiva, un brazo espaciador de MS-neutro y un reportero de MS / MS 10. Después de etiquetado, las muestras fueron sometidos a digestión con proteasa. Los péptidos marcados en cisteína se enriquecieron utilizando una resina que contiene anticuerpos anti-TMT. Durante MS / MS análisis, una serie de iones reportero (es decir, 126-131 Da) surgen en la región de baja masa, proporcionando información sobre la cuantificación relativa.El flujo de trabajo es eficaz para reducir la complejidad de la muestra, la mejora de rango dinámico y el estudio de las modificaciones de cisteína. Aquí presentamos el análisis de proteómica redox del tomate Pst DC3000 tratado (Río Grande) utilizando la tecnología deja cysTMT. Este método de alto rendimiento tiene el potencial de ser aplicado al estudio de otros redox reguladas procesos fisiológicos.
Este protocolo proporciona información sobre cómo realizar la tinción de DAB, así como la cuantificación cysTMT etiquetados cisteína redox. Estos procedimientos son beneficiosos en el examen de la producción de ROS, así como el efecto sobre la regulación de proteínas cuando Solanum lycopersicum se inocula con Pseudomonas syringae. Los métodos presentados en este protocolo de proporcionar una forma de examinar las ROS en muestras de hojas enteras de una manera que cause el mínimo de daño al tejido de la hoja. El procedimiento de etiquetado proporciona una forma de examinar las proteínas reguladas potencialmente redox mediante la utilización de un método de etiquetado cisteína. Esto es beneficioso cuando se examina una etapa temprana de la respuesta al estrés.
Métodos tales como etiqueta de afinidad isótopo codificado (ICAT) y cysTMT se puede utilizar en el examen de potenciales redox proteínas reguladas en muestras biológicas. ICAT permite el etiquetado y la comparación de dos muestras de 12. Ambos métodos etiquetar cisteínas libres y se puede utilizar para la proteína quantificción 10,12. Sin embargo, el método cysTMT permite una disminución en la variación experimental, así como multiplexación 10. El número de etiquetas disponibles permite a los investigadores para incluir repeticiones o varias muestras de su diseño experimental. La función más muestras proporciona el potencial para un mayor número de proteínas identificadas. Una desventaja importante de la técnica cysTMT es que compromete la calidad general de la identificación de proteínas debido a los pasos de enriquecimiento selectivo para cysTMT etiquetados-péptidos (6.5 a 6.6). El número de péptidos para la identificación de proteínas depende en gran medida el número de residuos de cisteína en la secuencia de la proteína. Este problema se puede superar mediante la presentación de parte de la muestra antes de tríptico enriquecimiento para la identificación de masa de la proteína espectrometría.
Debido a la naturaleza del diseño experimental, así como el mecanismo de etiquetado que utiliza el método cysTMT, ciertos pasos son críticos. Durante la realización de la proteína precisiónpitation y pellets de lavado (3,9) es importante para mantener las muestras refrigerados en hielo para reducir la degradación de proteínas. Durante etiquetado cysTMT, la eliminación del reactivo reductor (4,6) es importante porque las muestras pueden someterse etiquetado inverso. Etiquetado inversa es posible si la reducción de reactivo permanece en la muestra. Si las muestras se reduce después de etiquetado, la etiqueta cysTMT se puede quitar. Una vez que las etiquetas se añaden a las muestras, el nivel de pH debe ser revisado (4,7) con el fin de tener un rendimiento óptimo de etiquetado. Además, el análisis de datos depende de lo que se requiere del investigador y el objetivo final en el uso del protocolo. Es también depende del software utilizado, ya que cada software tiene diferentes algoritmos.
Este experimento utiliza patógeno como un desencadenante de una mayor producción de especies reactivas de oxidación en el tomate, sin embargo, otras respuestas regulados redox se puede medir en consecuencia. Este diseño experimental es adaptable a otra planta y sistemas animales. </p>
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al Dr. Greg Martin (Universidad de Cornell) y su grupo para proporcionar la cepa DC3000, semillas de tomate, y el asesoramiento. También quisiera agradecer al Dr. Zhonglin Mou busca de ayuda con el protocolo de DAB y la División de Proteómica del Centro Interdisciplinario de Investigación UF Biotecnología para la asistencia en el desarrollo del método. El protocolo para la extracción de proteína fue modificada de Hurkman y Tanaka 16. El protocolo sobre cysTMT etiquetado, los pasos 4 a 6 fue adaptado basado en el original producto de Thermo Fisher Scientific Pierce manual de 17. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (MCB 0,818,051 a S Chen).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
SpeedVac | Labconco | 7812013 |
Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
Trypsin | Promega | V5111 |
Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |