Reaktive oxygenformer niveau hæves, når celler støder stressbetingelser. Her viser vi eksempel 3'-3 'diaminobenzidin farvning såvel som cysTMT mærkning og massespektrometri for at profilere redox proteom med<em> Pseudomonas syringae</em> Behandlet tomatblade.
Pseudomonas syringae pv. Tomat stamme DC3000 ikke kun forårsager bakteriel plet sygdom Solanum lycopersicum, men også på Brassica-arter, samt Arabidopsis thaliana, en genetisk medgørlige værtsplante 1,2. Akkumulering af reaktive oxygenarter (ROS) i kimbladene blev inokuleret med DC3000 indikerer en rolle for ROS ved modulering nekrotisk celledød under bakteriel plet sygdom tomat 3. Hydrogenperoxid, en bestanddel af ROS, fremstilles efter inokulering af tomatplanter med Pseudomonas 3. Hydrogenperoxid kan detekteres ved anvendelse af en histokemisk plet 3'-3 'diaminobenzidin (DAB) 4. DAB farvning reagerer med hydrogenperoxid til frembringelse af en brun plet på bladvæv 4. ROS har en regulatorisk rolle af den cellulære redox miljø, hvilket kan ændre redox status for visse proteiner 5. Cystein er en vigtig aminosyre følsom overredox ændringer. Under mild oxidation tjener reversibel oxidation af cystein sulfhydrylgrupper som redox sensorer og signaltransducere der regulerer en række fysiologiske processer 6,7. Tandem masse tag (TMT) reagenser muliggøre samtidig identifikation og multiplekses kvantificering af proteiner i forskellige prøver med tandem-massespektrometri 8,9. De cystein-reaktive TMT (cysTMT) reagenser muliggøre selektiv mærkning og relative kvantificering af cystein-holdige peptider fra op til seks biologiske prøver. Hver isobarisk cysTMT tag har den samme nominelle modermassen og er sammensat af en sulfhydryl-reaktiv gruppe, en MS-neutral spacerarm, og en MS / MS reporter 10. Efter mærkning blev prøverne underkastet proteasespaltning. De cystein-mærkede peptider blev beriget ved hjælp af en harpiks indeholdende anti-TMT-antistof. Under MS / MS-analyse, opstår en række reporter ioner (dvs. 126-131 Da) i lav masse regionen, give oplysninger om relativ kvantificering.Arbejdsgangen er effektiv til at reducere prøve kompleksitet, bedre dynamikområde og studere cystein modifikationer. Her præsenterer vi redox proteom analyse af Pst DC3000 behandlede tomat (Rio Grande) forlader hjælp cysTMT teknologi. Dette high-throughput-metoden har potentialet til at blive anvendt til at studere andre redox-regulerede fysiologiske processer.
Denne protokol indeholder oplysninger om udførelse af DAB farvning samt cysTMT mærket redox cystein kvantificering. Disse procedurer er gavnlige i at undersøge produktionen af ROS samt effekt på protein regulering, når Solanum lycopersicum inokuleres med Pseudomonas syringae. De metoder, der præsenteres i denne protokol tilvejebringe en måde at undersøge ROS i hele bladprøver på en måde, der forårsager den mindste mængde af beskadigelse bladvæv. Mærkningen fremgangsmåde tilvejebringer en måde til at undersøge potentielle redox reguleret proteiner ved anvendelse af en cystein mærkningsmetode. Dette er nyttigt, når behandlingen af en tidlig fase af stress respons.
Fremgangsmåder, såsom isotop-kodet affinitetsmærke (ICAT) og cysTMT kan anvendes i behandlingen af potentielle redox regulerede proteiner i biologiske prøver. ICAT tillader mærkning og sammenligning af to prøver 12. Begge metoder mærke frie cysteiner og kan anvendes til protein quantification 10,12. Imidlertid cysTMT fremgangsmåde muliggør en reduktion i eksperimentelle variation samt multipleksering 10. Antallet af tags til rådighed giver forskerne til også at omfatte replikater eller flere prøver i deres eksperimenterende design. Under flere prøver giver mulighed for et højere antal identificerede proteiner. En væsentlig ulempe ved cysTMT teknik er, at det bringer den samlede kvalitet af protein identifikation på grund af de selektive berigelse trin til cysTMT mærkede-peptider (6,5-6,6). Antallet af peptider til proteiner identifikation afhænger i høj grad antallet af cysteinrester i proteinsekvensen. Dette problem kan overvindes ved indgivelse del af tryptiske prøven før tilsætning til massespektrometri protein identifikation.
På grund af arten af det eksperimentelle design samt mærkning mekanisme at cysTMT fremgangsmåde anvender visse trin er afgørende. Under udførelsen af protein præcisionpitation og pellet vaskevæsker (3,9) er det vigtigt at holde prøverne afkølet på is til reduktion af proteinnedbrydning. Under cysTMT mærkning, er fjernelse af den reducerende reagens (4,6) vigtigt, fordi prøver kan undergå omvendt mærkning. Revers mærkning er mulig, hvis reducerende reagens forbliver i prøven. Hvis prøver reduceret efter mærkning, kan cysTMT mærket fjernes. Når etiketterne tilsættes til prøverne, må pH kontrolleres (4,7) for at have optimal mærkning effektivitet. Desuden er dataanalyse afhængig af, hvad der kræves af forskeren og det ultimative mål i at bruge protokollen. Det er også afhængig af den software, der anvendes som hver software har forskellige algoritmer.
Dette eksperiment anvender patogen som en elicitor til forøget produktion af reaktive oxidative arter i tomat, dog kan andre redox regulerede reaktioner måles i overensstemmelse hermed. Det eksperimentelle design kan tilpasses til andre plante-og dyrearter systemer. </p>
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Greg Martin (Cornell University) og hans gruppe for at give DC3000 stamme, tomatfrø, og rådgivning. De vil også gerne takke Dr. Zhonglin Mou for at få hjælp med DAB-protokollen og Proteomics afdelingen UF Interdisciplinært Center for Bioteknologi Forskningscenter for bistand til metodeudvikling. Protokollen for protein ekstraktion blev ændret fra Hurkman og Tanaka 16. Protokollen om cysTMT mærkning, trin 4 til 6 blev tilpasset baseret på den oprindelige Thermo Pierce Fisher Scientific produktmanual 17. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation (MCB 0818051 til S Chen).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
SpeedVac | Labconco | 7812013 |
Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
Trypsin | Promega | V5111 |
Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |