Reaktive oksygen arter nivå er forhøyet når cellene støter stress forhold. Her viser vi eksempel på 3'-3 'diaminobenzidine farging samt cysTMT merking og massespektrometri for å profilere redoks proteomet i<em> Pseudomonas syringae</em> Behandlet tomatblader.
Pseudomonas syringae pv. Tomat stamme DC3000 ikke bare forårsaker bakteriell flisen sykdom i Solanum lycopersicum men også på Brassica arter, samt på Arabidopsis thaliana, en genetisk medgjørlig vertsplanten 1,2. Oppbyggingen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) i cotyledons inokulert med DC3000 indikerer en rolle av ros i modulerende nekrotisk celledød i løpet av bakteriell fnugg sykdom av tomat tre. Hydrogen peroxide, en komponent av ros, er produsert etter inokulering av tomatplanter med Pseudomonas tre. Hydrogenperoksid kan oppdages ved hjelp av en histochemical flekk 3'-3 'diaminobenzidine (DAB) 4. DAB farging reagerer med hydrogenperoksid for å produsere en brun flekk på bladet vev 4. ROS har en regulerende rolle den cellulære redoks miljø, som kan endre redoks status av visse proteiner fem. Cystein er en viktig aminosyre følsomme forredoks endringer. Under mild oksidasjon, serverer reversibel oksidasjon av cystein sulfhydryl grupper som redoks sensorer og signal transdusere som regulerer en rekke fysiologiske prosesser 6,7. Tandem masse tag (TMT) reagenser gjør samtidig identifisering og multiplekset kvantifisering av proteiner i ulike prøver ved hjelp tandem massespektrometri 8,9. De cystein-reaktive TMT (cysTMT) reagenser aktivere selektiv merking og relativ kvantifisering av cystein som inneholder peptider fra opptil seks biologiske prøver. Hver isobaric cysTMT tag har samme nominelle forelder masse og er sammensatt av en sulfhydryl-reaktiv gruppe, en MS-nøytral spacer arm og en MS / MS reporter 10. Etter merking ble prøvene gjenstand for protease fordøyelsen. De cystein-merkede peptider ble beriket med en harpiks som inneholder anti-TMT antistoff. Under MS / MS-analyse, en rekke reporter ioner (dvs. 126-131 Da) dukke opp i lav masse regionen, gir informasjon om relativ kvantifisering.Arbeidsflyten er effektive for å redusere prøve kompleksitet, bedre dynamisk omfang og studere cystein modifikasjoner. Her presenterer vi redoks proteomikk analyser av Pst DC3000 behandlet tomat (Rio Grande) forlater hjelp cysTMT teknologi. Denne high-throughput metoden har potensial til å bli brukt til å studere andre redoks-regulerte fysiologiske prosesser.
Denne protokollen gir informasjon om hvordan du utfører DAB farging samt cysTMT merket redoks cystein kvantifisering. Disse prosedyrene er gunstig i å undersøke produksjon av ros samt effekt på protein regulering når Solanum lycopersicum er inokulert med Pseudomonas syringae. Metodene som presenteres i denne protokollen gir en måte å undersøke ROS i hele blad prøver på en måte som forårsaker minst mulig skade på blad vev. Merkingen prosedyren gir en måte å undersøke potensielt redoks regulert proteiner ved å benytte en cystein merking metode. Dette er gunstig når du undersøker et tidlig stadium av stressrespons.
Metoder som isotop-kodet affinitet tag (ICAT) og cysTMT kan brukes i å undersøke potensielle redoks regulerte proteiner i biologiske prøver. ICAT tillater merking og sammenligning av to utvalg 12. Begge metodene merke frie cysteines og kan brukes for protein quantificasjon 10,12. Imidlertid lar cysTMT metode for en nedgang i eksperimentell variasjon samt multipleksing 10. Antallet koder tilgjengelig tillater forskerne å inkludere replikater eller flere prøver i sin eksperimentelle design. Å ha flere prøver gir mulighet for et høyere antall proteiner identifisert. En stor ulempe av cysTMT teknikken er at den kompromitterer generelle kvaliteten på protein identifikasjon på grunn av de selektive berikelse trinnene for cysTMT merket-peptider (06.05 til 06.06). Antallet peptider for protein identifikasjon avhenger i stor grad av antall cystein rester i protein sekvensen. Dette problemet kan overvinnes ved å sende en del av tryptic prøven før berikelse for massespektrometri protein identifikasjon.
På grunn av beskaffenheten av den eksperimentelle design samt merking mekanisme som cysTMT metoden benytter, visse trinn er kritisk. Når du utfører protein presipitation og pellet vask (3,9) er det viktig å holde prøvene kjølt på is for å redusere protein degradering. Under cysTMT merking, er fjerning av å redusere reagensen (4.6) viktig fordi prøvene kan gjennomgå omvendt merking. Omvendt merking er mulig hvis redusere reagens forblir i prøven. Dersom prøvene er redusert etter merking, kan den cysTMT tag bli fjernet. Når etikettene er lagt til prøvene, må pH kontrolleres (4.7) for å få optimal merking effektivitet. I tillegg er dataanalyse avhengig av hva som kreves av forskeren og det ultimate målet i bruk av protokollen. Det er også avhengig av hvilken programvare som blir brukt som hver programvare har ulike algoritmer.
Dette eksperimentet benytter patogenet som en elicitor for økt produksjon av reaktive oksidative arter i tomat, men kan andre redoks regulerte responser måles tilsvarende. Dette eksperimentelle designet er tilpasningsdyktig til andre planter og dyr systemer. </p>
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Greg Martin (Cornell University) og hans gruppe for å gi DC3000 belastningen, tomat frø og råd. De vil også gjerne takke Dr. Zhonglin Mou for hjelp med DAB protokollen og Proteomikk divisjon ved UF tverrfaglig senter for bioteknologi Forskning for bistand til metodeutvikling. Protokollen for protein utvinning ble endret fra Hurkman og Tanaka 16. Protokollen på cysTMT merking, trinn 4 til 6 ble tilpasset basert på den opprinnelige Thermo Pierce Fisher Scientific produktmanualen 17. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation (MCB 0.818.051 til S Chen).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
SpeedVac | Labconco | 7812013 |
Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
Trypsin | Promega | V5111 |
Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |