活性氧水平升高,当细胞遇到压力条件。在这里,我们表明3'-3'二氨基联苯胺染色的例子,以及cysTMT标签和质谱分析的氧化还原蛋白质在<em>野火</em>处理番茄叶片。
野火光伏番茄应变DC3000不仅会导致细菌性斑点病在马铃薯lycopersicum,但也对甘蓝型油菜品种,以及对拟南芥 ,一种基因听话的寄主植物1,2。番茄细菌性斑点病过程中积累的活性氧(ROS),在与DC3000接种子叶表明了ROS在调节细胞坏死的作用。过氧化氢 ,活性氧的一个组成部分,是假单胞菌番茄植株接种后产生的。可以检测过氧化氢 ,使用1组织化学染色3'-3'二氨基联苯胺(DAB)4。 DAB染色与过氧化氢 反应生成棕色染色的叶组织4。 ROS有一个细胞的氧化还原环境,它可以改变某些蛋白质的氧化还原状态的调节作用。半胱氨酸是一种重要的氨基酸,敏感氧化还原的变化。轻度氧化下,可逆的氧化半胱氨酸的巯基氧化还原传感器和信号转导,调节各种生理过程6,7。串联质谱标记(TMT)的试剂能够同时识别和定量蛋白质在不同的样品采用串联质谱法8,9复。半胱氨酸反应TMT(cysTMT)试剂可以选择性的标签和相对定量半胱氨酸的肽含有多达6个生物样品。每个的恒压cysTMT标签具有相同标称父的质量和组成的巯基反应组,一个MS-中性间隔臂和一个MS / MS记者10。样品标签后,蛋白酶消化。使用含有反TMT抗体树脂富集半胱氨酸标记的肽。在MS / MS分析,出现一系列的记者离子(即达126-131),在低质量的区域,提供相对定量的信息。工作流是有效降低样品的复杂性,提高动态范围和研究半胱氨酸修改。在这里,我们提出的Pst DC3000处理番茄的氧化还原蛋白质组分析(格兰德河)离开使用cysTMT技术。这种高通量的方法,有可能被应用到研究其他的氧化还原调节生理过程。
该协议提供的信息以及执行DAB染色标记的cysTMT氧化半胱氨酸量化。有利于在研究生产的活性氧以及蛋白质调控的效果接种野火马铃薯lycopersicum时,这些程序。在这个协议中提出的方法提供了一种方法来研究在叶组织的损害最少的方式,导致活性氧在整个叶样品。标签程序提供了一种利用半胱氨酸标记法检查潜在的氧化还原调节蛋白。审查时应激反应的早期阶段,这是有益的。
如同位素编码亲和标签(ICAT)和cysTMT方法可用于研究生物样品中潜在的氧化还原调节蛋白。 ICAT的允许标签和比较两个样本12。两种方法标记的半胱氨酸可以用于蛋白quantificATION 10,12。然而,cysTMT方法允许在实验变异的减少以及复10。标签的数量,使研究人员,包括复制或多个样品,在他们的实验设计。有更多的样本,提供了一个确定蛋白质较多的潜力。一个的cysTMT技术的主要缺点是,它破坏蛋白质鉴定为cysTMT标记肽(6.5-6.6)的选择性富集步骤的整体素质。在很大程度上取决于半胱氨酸残基在蛋白质序列的多肽蛋白质鉴定。富集质谱蛋白质鉴定前提交的胰蛋白酶样品的一部分,这个问题是可以克服的。
由于实验设计以及标签机制,cysTMT方法利用的性质,某些步骤是至关重要的。在执行蛋白质精度pitation和沉淀洗涤(3.9),它是重要保持冰上样品,以减少蛋白质的降解。在cysTMT标签,去除还原剂(4.6)是重要的,因为样品可以进行反向的标签。反向标签是可能的,如果减少试剂样品中仍然。如果样品标签后减少,cysTMT的标签可以被删除。一旦标签被添加到样品,pH值必须检查(4.7)为了有最佳的标记效率。此外,数据分析是依赖于需要的研究员,在使用该协议的最终目标是什么。它也被用来作为每个软件都有不同的算法软件的依赖。
本实验利用作为提高生产番茄活性氧物种的激发子病原体;然而,其他调节氧化还原反应,可测得相应。这个实验设计是适应其他植物和动物系统。 </P>
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢格雷格·马丁博士(康奈尔大学)和他的研究小组提供的DC3000应变,番茄种子,和建议。他们也想感谢督博士牟民建联协议蛋白质组学研究部和用友生物技术研究的跨学科方法开发援助中心的帮助。蛋白提取协议修改从Hurkman和田中16。适应cysTMT标签,步骤4至6条的协议,根据原来的热皮尔斯尔科技产品手册17。这项工作是由国家科学基金会(MCB的0818051小陈)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
SpeedVac | Labconco | 7812013 |
Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
Trypsin | Promega | V5111 |
Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |