Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Robert DeRose; Christopher Pohlmeyer; Nobuhiro Umeda; Tasuku Ueno; Tetsuo Nagano; Scot Kuo; Takanari Inoue

doi:10.3791/3794

JoVE Journal > Bioengineering

Bioengineering

Spatio-tidsmæssige Manipulation af Lille GTPase aktivitet på Subcellulær niveau og på Tidsplan for Seconds i levende celler

Published: March 09, 2012

doi:

10.3791/3794

Robert DeRose, Christopher Pohlmeyer, Nobuhiro Umeda², Tasuku Ueno², Tetsuo Nagano, Scot Kuo³, Takanari Inoue

¹Department of Cell Biology, Center for Cell Dynamics,Johns Hopkins University, ²Graduate School of Pharmaceutical Sciences,University of Tokyo, ³Biomedical Engineering,Johns Hopkins University

Summary

En fremgangsmåde til spatio-temporal kontrol lille GTPase-aktivitet af lys, er beskrevet. Denne metode er baseret på rapamycin-induceret FKBP-FRB heterodimerisering og foto-bure systemer. Optimering af lys-bestråling muliggør spatio-tidsmæssigt styret aktivering af små GTPaser på det subcellulære niveau.

Abstract

Dynamisk regulering af Rho familie af små guanosin triphosphatases (GTPaser) med stor spatiotemporal præcision er nødvendig for forskellige cellulære funktioner og arrangementer ^{1, 2.} Deres spatiotemporally dynamiske karakter er blevet afsløret ved hjælp af visualisering af deres aktivitet og lokalisering i realtid ^3. For at opnå en dybere forståelse af deres roller i forskellige cellulære funktioner på det molekylære niveau, bør næste skridt være forstyrrelse af protein aktiviteter på en præcis subcellulære placering og timing.

For at nå dette mål, har vi udviklet en fremgangsmåde til lysinduceret, spatio-tidsmæssigt styret aktivering af små GTPaser ved at kombinere to teknikker: (1) rapamycin-induceret FKBP-FRB heterodimerisering og (2) en foto-bure metode rapamycin. Med anvendelse af rapamycin-medieret FKBP-FRB heterodimerisering, har vi udviklet en fremgangsmåde til hurtig inducerbare aktivering eller inaktivering af små GTPaser including Rac ^4, Cdc42 ^4, RhoA ⁴ og Ras ^5, hvor rapamycin inducerer translokation af FKBP-kondenserede GTPaser, eller deres aktivatorer, til plasmamembranen, hvor FRB er forankret. Til kobling med dette heterodimerisering system, har vi også udviklet en foto-bure system rapamycin analoger. Et foto-bur forbindelsen er et lille molekyle, hvis aktivitet er undertrykt med en fotospaltelig beskyttende gruppe kendt som en anbringelse i bur gruppe. At undertrykke heterodimerisering aktivitet fuldstændigt vi udviklet en bur rapamycin, som er bundet til et makromolekyle, således at den resulterende store komplekset ikke kan krydse plasmamembranen, hvilket fører til praktisk talt ingen baggrund aktivitet som en kemisk dimerizer i celler ^6. Figur 1 illustrerer et skema i vores system. Med kombinationen af disse to systemer, lokalt har vi ansat en Rac aktivator til plasmamembranen på en tidsskala sekunder og opnåede lys-induceret Rac aktivering på det subcellulære Level ^6.

Protocol

1. Transfektion af plasmid DNA Tilsættes plasmid-DNA'er, 0,5 ug membran-bundne FRB (herefter benævnt LDR) og 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cellelymfom invasion og metastase-inducerende protein 1: Rac aktivator) mærket med fluorescerende protein til 37,5 gl dH 2 O. Tilsæt 1 gl FuGENE HD. Vortex, og der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. I mellemtiden, skal du fortsætte til trin 1,3-1,8. Vaske hver brønd i en 8-brønds kammer med 50 ul poly-D-lysin. Vask i midt…

Discussion

Beskrev vi en teknik, der anvender en hidtil ukendt bur forbindelse sammen med FKBP-FRB heterodimerisering systemet for at manipulere Rho GTPase-aktivitet ved en præcis subcellulære lokalisering på en tidsskala sekunder.

Der er tre begrænsninger af den foreliggende fremgangsmåde. For det første fordi metoden er baseret på at forhindre eller tillade diffusion af dimerizer over plasmamembranen, målet cellulære placering skal være plasmamembranen eller dens nærhed. Yderligere optimer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af NIH finansiering af forskning (DK090868 og GM092930 til TI). Der er en verserende patent på et indhegnet rapamycin analog.

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number
Rapamycin	Tecoland	RAPA99
FuGENE HD	Roche	04709691001
Avidin	Sigma	A9275-10MG
DMSO	Sigma	D2650-5X5ML
Size-exclusion column	GE Healthcare	Spin Trap G-25
Glass bottom 8-well chamber	Thermo Scientific	12-565-47
Inverted Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert200M
UV LED light source	Rapp Opto Electronics	UVILED
Confocal spinning disk	Yokogawa Electric Corp.	CSU10
CCD camera	Hamamatsu Photonics	ORCA-ER
100x Objective lens	Zeiss	Plan Apochromat

Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011)⁶

Synthetic conditions: (a) BnBr, K₂CO₃, DMF (b) f.HNO₃, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K₂CO₃, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH₃CN, TiCl₄, MeCN (g) Tf₂O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH₄, THF (j) TsCl, Pyridine, CH₂Cl₂ (k) NaN₃, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH₂Cl₂ (m) 13, CuSO₄, Ascorbate, 2-propanol, H₂O, CH₂Cl₂.

References

Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

DeRose, R., Pohlmeyer, C., Umeda, N., Ueno, T., Nagano, T., Kuo, S., Inoue, T. Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells. J. Vis. Exp. (61), e3794, doi:10.3791/3794 (2012).