वास्तविक समय, TCR के साथ - साथ इमेजिंग और उसके एसोसिएटेड संकेतन प्रोटीन के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोपी तकनीक

Summary

इसलिए, संकेत यह शामिल प्रोटीन के स्थानिक और लौकिक व्यवहार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है समझ करने के लिए, या तो प्लाज्मा झिल्ली के भीतर या स्थानों में intracellular प्रोटीन की compartmentalization एक नियामक तंत्र है कि बहुत से संकेत परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. हम यहाँ एक TIRF माइक्रोस्कोपी आधारित प्रणाली टी कोशिकाओं में संकेत पारगमन अध्ययन का वर्णन है, लेकिन मोटे तौर पर लागू है.

Abstract

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCRαβ heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the εδ and εγ heterodimers and the ζζ homodimer)¹. Upon engagement of the receptor, the CD3 ζ chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules².

The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation². TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors ^3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.

One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously^5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface ^7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCRβ, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands ^9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ^12-16.

Protocol

प्रयोगात्मक प्रक्रिया: 1. अभिकर्मक का उपयोग Amaxa माउस टी सेल Nucleofector किट हम यहाँ या तो भोले या इन विट्रो सक्रिय अभिव्यक्ति के GFP द्वारा टैग संकेतन अणुओं कूटबन्धन, प्लास्मिड Amaxa माउस टी सेल Nucleofector किट का उपयोग के साथ प्राथमिक टी कोशिकाओं के अभिकर्मक का वर्णन. पेप्टाइड लोड प्लीहा APCs का उपयोग टी कोशिकाओं की इन विट्रो में सक्रियण के रूप में 7 से पहले वर्णित किया जाता है. सभी टी कोशिकाओं हमारे अध्ययन में इस्तेमाल किया TCR और एमसीसी (88-103) पेप्टाइड MHC अणु आईई कश्मीर के लिए बाध्य पहचानता व्यक्त करते हैं. अभिकर्मक बाहर किया जाता है अनिवार्य रूप से निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, तथापि, हम कुछ सुझाव है कि अभिकर्मक के बाद टी कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ावा देने की वर्तमान. दोनों व्यवहार्यता और अभिकर्मक दक्षता बहुत भोले कोशिकाओं की तुलना में इन विट्रो सक्रिय टी कोशिकाओं में अधिक है. शुरू करने से पहले, 20 की μL जोड़कर पूरक टी सेल के माध्यम की 2 एमएल तैयारदोनों मध्यम अवयव और बी प्रत्येक अभिकर्मक के लिए और भ्रूण गोजातीय सीरम के 100 μL (5%) प्रदर्शन किया जाएगा. एक humidified 37 में 12 अच्छी तरह से थाली में मध्यम संतुलित करना डिग्री सेल्सियस, 5% कम से कम एक घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर. वैकल्पिक रूप से, मध्यम की aliquots 5% सीरम और घटक एक और तैयार किया जा सकता है संग्रहित जमे हुए के साथ पूरक हैं. यदि यह मामला है, aliquots की अपेक्षित संख्या पिघलना, घटक बी जोड़ने, और संतुलन. माध्यम की पूर्व संतुलन बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में सेल मौत अभिकर्मक के बाद कोशिकाओं के मध्यम में है कि या तो ठंडा है या अन्य पीएच 7.2 से है फिर से निलंबन से परिणाम होगा. आगे अभिकर्मक मिश्रण तैयार. 2 अनुपूरक 18 μL और प्लास्मिड डीएनए के 5μg (एकाग्रता कम 0.5 μg / μl) के साथ, माउस टी सेल Nucleofector के समाधान के 82 μL का मिश्रण. ट्यूब दोहन या सूक्ष्म विंदुक के उपयोग के साथ मिश्रण अच्छी तरह से. -यह महत्वपूर्ण है के प्लाज्मिड खुराक की कोशिकाओं के प्रत्येक अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया जा निर्माण के लिए एक निश्चित संख्या के लिए एक टाइट्रेट करना प्रदर्शन. कुछ बड़े constructs के लिए, अधिक डीएनए की आवश्यकता हो सकती है. डीएनए endotoxins से मुक्त होना चाहिए. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए 5 से 10 लाख कोशिकाओं स्थानांतरण. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 600 rpm पर अपकेंद्रित्र. के रूप में एक निर्वात चूषित्र के साथ संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के बहुत निकालें. निर्माताओं – कम से कम 90x जी पर कोशिकाओं कताई की सलाह देते हैं, हमारे मामले में, इस गति 75x जी को मेल खाती है. एक सेल प्राप्त करने के लिए चुना रिश्तेदार केन्द्रापसारक बल (आरसीएफ) गोली शायद सबसे महत्वपूर्ण चर रहा है, कम आरसीएफ पर centrifugation के रूप में कोशिका झिल्ली को नुकसान को अलग करता है. अभिकर्मक मिश्रण में धीरे से सेल गोली और पुनः निलंबित धीरे धीरे सेल गोली pipeting जब तक वहाँ शेष कोशिकाओं के बड़े clumps हैं. यह आम तौर पर पूरी तरह से कोशिकाओं टी aspirating के द्वारा पूरा किया जा सकता हैविंदुक टिप hrough 3-4 बार से अधिक नहीं. एक विंदुक का प्रयोग, प्रमाणित Amaxa क्युवेट में ध्यान से निलंबन हस्तांतरण सुनिश्चित करना है कि वहाँ कोई वर्तमान बुलबुले हैं. क्युवेट कैप. चुनें Nucleofector डिवाइस पर Nucleofector कार्यक्रम एक्स-001. Nucleofector क्युवेट धारक में क्युवेट डालें और चयनित कार्यक्रम लागू होते हैं. – कोशिकाओं electroporating के बाद, यह सबसे अच्छा है उन्हें तुरंत पूर्व equilibrated संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरित. निर्माताओं की सिफारिश है कि कोशिकाओं के लिए 15 मिनट से अधिक नहीं nucleofector मध्यम में रखा जाना है. क्युवेट और हुड के लिए पूर्व equilibrated, पूरी तरह से पूरक संस्कृति मध्यम लाओ. प्रदान की प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग, क्युवेट करने के लिए माध्यम के लगभग 500 μL जोड़ने और मध्यम करने के लिए ड्रॉप द्वारा ड्रॉप थाली में सेल निलंबन हस्तांतरण. 37 ° C कोशिकाओं इमेजिंग से पहले 4 घंटे के लिए सेते हैं. भोले कोशिकाओं incubat हैंएड में 30 ° सी बजाय 37 डिग्री सेल्सियस यह उनके प्रतिजन के लिए जेट को बनाए रखने में मदद करता है. – ऊष्मायन के तीन से चार घंटे के आम तौर पर टी कोशिकाओं के लिए पर्याप्त detectably GFP टैग प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं. हम इस समय बिंदु पर छवि कोशिकाओं को चुना है क्योंकि अभिव्यक्ति का स्तर कम है और अधिक अभिव्यक्ति की कलाकृतियों को कम से कम किया जाना चाहिए. यदि एक विशेष प्रोटीन की अभिव्यक्ति वांछित है, लेकिन, टी कोशिकाओं Amaxa माध्यम से 4 घंटे के बाद हटा दिया जाना चाहिए. यह फिर से कम आरसीएफ में के कोशिकाओं pelletting और पूर्व equilibrated टी सेल संस्कृति 2 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के घनत्व में 50 यू / एमएल (आईएल -2) 2 इंटरल्युकिन के साथ पूरक मध्यम में resuspending द्वारा पूरा किया है. 2. TIRF माइक्रोस्कोपी TIRF माइक्रोस्कोप का विवरण: सामान्य विन्यास: ऑप्टिकल घटकों एक ओलिंप IX71 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप है कि मूल रूप से एक ओलिंप TIRF मॉड्यूल के साथ सुसज्जित किया गया के आसपास बनाए गए थे. हम जल्द ही diइस मॉड्यूल में scovered रंगीन प्रभाव जब एक संरेखण राज्य के विभिन्न तरंगदैर्य लेजर लाइनों के लिए संपाती संधान नहीं हासिल किया. इस मॉड्यूल है, इसलिए, एक साथ TIRF इमेजिंग के लिए विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्य का उपयोग की अनुमति नहीं है, और हम बाहर सेट के लिए एक कस्टम TIRF उपकरण है कि प्रणाली में रंगीन प्रभाव कम से कम, के रूप में हम निम्न अनुभागों में विस्तार से चर्चा का निर्माण होगा. यहां वर्णित विधि 150 एक्स बढ़ाई के लिए विकसित किया गया था, 1.45 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) TIRFM उद्देश्य (ओलिंप) लेकिन 60 एक्स बढ़ाई, 1.45 एनए संस्करणों के लिए बस के रूप में अच्छी तरह से काम करता है. विस्तृत क्षेत्र रोशनी के लिए, धातु halide लैम्ब्डा-एक्स्ट्रा लार्ज प्रकाश स्रोत और एक उत्तेजना फिल्टर (Sutter उपकरण) पहिया उत्तेजना फिल्टर के साथ लगे माइक्रोस्कोप से जुड़ा है. नमूना मंच के उद्देश्य के लिए सम्मान के साथ स्वचालित स्थिति के लिए, माइक्रोस्कोप एक motorized XY अनुवाद, piezo नियंत्रित Z मंच (एएसआई) के साथ सुसज्जित है. छवियाँ दो समान Qu का उपयोग कर कब्जा कर रहे हैंantEM इलेक्ट्रॉन गुणा (EM) सीसीडी कैमरों (Photometrics). इन कैमरों के पिक्सेल आकार 150 एक्स TIRF उद्देश्य द्वारा की पेशकश की बढ़ाई साथ बहुत अच्छी तरह से मेल खाता है, पिक्सेल प्रति 0.1 माइक्रोन के अंतिम संकल्प दे रही है. EMCCD कैमरों भी GFP अभिव्यक्ति के स्तर कम होने transfectants कल्पना करने के लिए संवेदनशीलता प्रदान करते हैं. लेजर: TIRF रोशनी, 5 लेज़रों के एक प्रणाली 6 लेजर लाइनों (405, 440, 488, 514, 561, और 640 एनएम) के एक कुल देने के लिए एक फाइबर एकल मोड (Solamere टेक्नोलॉजीज) में युग्मित है. आर्गन लेजर और 561 एनएम डायोड ठोस राज्य (DPSS) पंप लेजर (488 लाइनों, 514 और 561) acousto ऑप्टिकल तीव्रता नियंत्रण के लिए ट्यून करने योग्य फाइबर (AOTF) के माध्यम से कराई हैं जबकि डायोड लेज़रों (405, 440 और 640 की तीव्रता ) एनएम अपनी बिजली की आपूर्ति के modulating वोल्टेज के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. AOTF और डायोड लेज़रों बिजली की आपूर्ति वोल्टेज एक डाटा अधिग्रहण (डीएसी) कार्ड बोर्ड (मापन कम्प्यूटिंग) Metamorph सॉफ्टवेयर (Molecu का उपयोग कर के माध्यम से नियंत्रित किया जाता हैउपकरणों के लोकप्रिय). डायोड लेज़रों के लिए युग्मन दक्षता 30% है, जबकि आर्गन और DPSS लेज़रों के उन लगभग 60% उनके छोटे व्यास बीम के कारण कर रहे हैं. TIRF मॉड्यूल: आदेश में एक साथ छवि TCR और उसके संबंधित संकेतन अणुओं, जैसा कि पहले बताया, यह आवश्यक था कि वार्णिक रूप से ठीक किया गया था कि फिर से संगठित करना या refocusing की आवश्यकता नहीं है जब विभिन्न तरंगदैर्य के उत्सर्जन प्रतिदीप्ति प्राप्त TIRF रोशनी है. TIRFM के माध्यम से – उद्देश्य रोशनी, के रूप में 17 से पहले वर्णित का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था. फाइबर ऑप्टिक केबल है कि खुर्दबीन के लिए लेजर प्रकाश उद्धार एक फाइबर एक XY फाइबर के सुक्ष्ममापी संचालित जेड समायोजन Thorlabs () के लिए ऑप्टिकल रेल के ऊपर घुड़सवार धारक के साथ फिट लांच में सुरक्षित किया गया था. TIRF रोशनी प्राप्त करने के लिए, लेजर बीम उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित दो लेंस ((collimating लेंस) L1 और L2 के (ध्यान केंद्रित लेंस) चित्र 1 में) की एक प्रणाली का उपयोग, ताकि खविदेश मंत्री का उद्देश्य में collimated उभर. यह सुनिश्चित करता है कि उद्देश्य से बाहर आने के प्रकाश की किरणों नमूना विमान के लिए सम्मान के साथ एक ही कोण होगा. फाइबर ऑप्टिक की नोक collimating लेंस का फोकस पर तैनात है. Collimating लेंस (Z दिशा) के लिए सम्मान के साथ ऑप्टिकल रेल के साथ सुक्ष्ममापी चलती यह संभव है करने के लिए बीम का ध्यान केंद्रित समायोजित बीम और एक्स और वाई XY समायोजन knobs का उपयोग करने की स्थिति में ले जाएँ. 150 एक्स उद्देश्य की बहुत छोटी एपर्चर वापस करने के लिए कारण, हमने पाया कि TIRF, वापस नाभीय विमान छोटे होने की जरूरत पर लेजर हाजिर आकार प्राप्त करने के लिए. छोटी सी जगह का निर्माण करने के लिए आवश्यक ध्यान केंद्रित करने को प्राप्त करने, छोटे फोकल लम्बाई लेंस आवश्यक (Keir Neumann के, व्यक्तिगत संचार) थे, इसलिए, हम लगभग 108 मिमी की एक नाभीय लंबाई कि dichroic घन में रखा गया था के साथ एक ध्यान केंद्रित लेंस का इस्तेमाल सीधे पूर्ववर्ती उद्देश्य. collimating लेंस बीम फाड़नेवाला कि तिवारी में लाया करने के लिए करीब रखा गया थाआरएफ रोशनी. अवांछित रंगीन प्रभाव को कम करने के लिए, हम अवर्णी दोहरी (वार्णिक रूप से सही fusing के दो लेंस विभिन्न अपवर्तक सूचकांक की सामग्री से बने तत्वों द्वारा किए गए लेंस) antireflection कोटिंग्स के साथ दोनों collimating और ध्यान केंद्रित लेंस (JML ऑप्टिकल) के लिए. ध्यान जाँच कि बीम के उद्देश्य collimated में उभर जब वापस एपर्चर के बीच में तैनात है और कमरे के छत पर एक तंग जगह के रूप में करना चाहिए द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. ध्यान केंद्रित स्थान की स्थिति तो वाई दिशा में एपर्चर है जो कारण किरण बड़े कोण पर छवि विमान पर एकाग्र करने के लिए है के किनारे की ओर ले जाया जाता है, और अंततः, कुल आंतरिक प्रतिबिंब के लिए महत्वपूर्ण कोण हासिल की है. इन ऑप्टिकल घटकों का प्रयोग, हम 442 से 640 एनएम के तरंग दैर्ध्य के लिए ही संरेखण में एक साथ संधान हासिल की. एक एकल ऑप्टिकल संरेखण, इसलिए, हमें एक साथ कई तरंगदैर्य भर TIRFM प्रदर्शन की अनुमति दी. दोहरी कैमरा apparatus: अलग प्रतिदीप्ति दो अलग fluorophores से उत्पन्न होने वाले उत्सर्जन के साथ – साथ अधिग्रहण एक दोहरी कैमरा प्रणाली है जो दो तरंग दैर्ध्य श्रेणियों में dichroic दर्पण (चित्रा 2) के उपयोग के माध्यम से उत्सर्जन विभाजन के निर्माण के द्वारा प्राप्त किया गया था. उत्सर्जित प्रकाश माइक्रोस्कोप के दाईं ओर बंदरगाह के बाहर उद्देश्य से परिलक्षित होता है. के रूप में सबसे अधिक उद्देश्य हैं अनन्तता अनन्तता में गठित छवियों के साथ सही, एक ट्यूब लेंस छवि ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है. दो उत्सर्जन तरंगदैर्य के साथ हेरफेर करने के लिए, दाईं ओर बंदरगाह पर ट्यूब लेंस हटा दिया गया था. एक अनुकूलित अनुकूलक युक्त सी माउंट धागे (Sutter उपकरण) संलग्न किया गया था और dichroic दर्पण धारक (एडमंड प्रकाशिकी) से जुड़ा हुआ है. Dichroic दर्पण है कि कार्बनिक रंजक की TCR (Alexa546, Alexa647, आदि) का लेबल किया कि से GFP उत्सर्जन अलग इस धारक में स्थापित किया गया. इस मॉड्यूल दोनों प्रकाश पथ में एक ट्यूब लेंस धारक, एक उत्सर्जन फिल्टर धारक और विस्तार ट्यूबों के द्वारा पीछा किया गया था.ट्यूब लेंस (TL1 और TL2 (चित्रा 2)) 180 मिमी की एक नाभीय लंबाई है. आवारा प्रकाश से कैमरों ढाल विस्तार EM सीसीडी कैमरों के लिए अग्रणी ट्यूबों में अंतराल काले कागज के साथ कवर किया गया. दो चैनलों के संरेखण के लिए अनुमति देने के लिए, कैमरा दो कस्टम XYZ अनुवाद खड़ा (Holmarc उत्पाद में) पर घुड़सवार थे. नीचे हम वर्णन कैसे दो चैनल एक साथ इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप संरेखित करने के लिए. शामिल कदम TIRF रोशनी की aligning रहे हैं, लेसर शक्ति को समायोजित, और aligning के दो उत्पादन उप संकल्प microbeads छवियों का उपयोग कर. शुरू करने से पहले, माइक्रोस्कोप के सभी घटकों पर संचालित कर रहे हैं. कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर फिर से शुरू कर रहे हैं और यह सुनिश्चित है कि सभी हार्डवेयर घटकों सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. सह स्थानीयकरण एक मानक के रूप में उपयोग के लिए पीबीएस की 2 एमएल में 1 (0.2 माइक्रोन) उप संकल्प Fluoresbrite microspheres बहु फ्लोरोसेंट μL पतला और microsphere की 0.25 एमएल जोड़नेलैब टेक 8 अच्छी तरह से संभाग coverglass प्रणाली (Nunc) के द्वितीय की हर अच्छी तरह से करने के लिए निलंबन. उद्देश्य ऊपर मंच पर चैम्बर स्लाइड प्रणाली रखें. मोती है कि कांच के adsorbed के कर रहे हैं तो ध्यान में लाया जाता है. XYZ फाइबर लांच की वाई संरेखण का प्रयोग, लेजर बीम की स्थिति के उद्देश्य के पीछे एपर्चर के केंद्र में ले जाया जाता है. यह महत्वपूर्ण है यह करने के लिए जब उद्देश्य की स्थिति में है जहां कांच विमान ध्यान में है. यदि बीम collimated नहीं है, जेड सुक्ष्ममापी पूर्ण संधान को प्राप्त करने के लिए निकाला जाता है. संधान व्यक्तिगत रूप से सभी लेजर प्रयोग में इस्तेमाल किया जा लाइनों के लिए परीक्षण किया है. इस स्तर पर, प्रत्येक पंक्ति के लिए लेजर शक्ति का उपयोग करते हुए एक लेजर बिजली मीटर मापा जाता है और प्रत्येक चैनल में 20-30 μW समायोजित. – टी कोशिकाओं अत्यंत लेजर विकिरण के प्रति संवेदनशील हैं, और रोशनी 50 μW की कुल करने के लिए सीमित है. मोतियों की छवियाँ TIRF illuminat का उपयोग कर अर्जित कर रहे हैंजीना मोड में आयन. फाइबर लांच वाई संरेखण पर सुक्ष्ममापी इतना है कि बीम छत से दूर उद्देश्य ऑप्टिकल अक्ष 90 डिग्री दृष्टिकोण के लिए सम्मान के साथ अपने कोण तक बढ़ शुरू होता है बारी. अंत में, जब TIR के लिए महत्वपूर्ण कोण तक पहुँच जाता है, लेज़र प्रकाश अब नहीं उद्देश्य बाहर निकल जाएगा. TIRF संरेखण तो coverglass के विमान के माध्यम से ध्यान केंद्रित है और नीचे से माना जाता है. यदि मोती है कि समाधान में तैर रहे हैं visualized किया जा सकता है, तो उद्देश्य सामान्य आवश्यकताओं के सम्मान के साथ बीम के कोण को आगे वृद्धि करने के लिए. सही TIRF संरेखण में, केवल एक ऑप्टिकल विमान ध्यान में हो सकता है (यानी, केवल मोती है कि coverslip के लिए adsorbed के हैं). TIRF संरेखण का एक बेहतर परीक्षण जब इमेजिंग टी कोशिकाओं है कि एक सतह पर फैला है एक सतह डाई के साथ दाग लागू किया जा सकता है. (बिंदु 3.4 देखें). TIRF रोशनी के बाद हासिल किया गया है, दो चैनलों को एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ गठबंधन किया जा सकता है. मोती पर ध्यान दें और मैं की स्थिति की तुलनादोनों चैनलों में छवियों में dentifiable सुविधाओं का उत्पादन किया. एक कैमरा स्टैंड पर एक्स और वाई सुक्ष्ममापी शिकंजा का उपयोग कर, संभव के रूप में करीब निकटता के रूप में मोतियों की सापेक्ष स्थिति लाने के लिए. दोनों चैनलों से छवियों को बचाने के. इन छवियों को एक सह स्थानीयकरण मानक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा दो चैनलों पंक्ति. कैमरे भी तो गठबंधन किया है कि वे एक दूसरे को सम्मान के साथ parfocal हैं की जरूरत है. यह उप संकल्प मोती है कि Z दिशा में 100 एनएम से एक दूसरे से अलग कर रहे हैं की छवियों का एक सेट प्राप्त करने के द्वारा प्राप्त किया है. यदि मोती के लिए अधिकतम तीव्रता पिक्सेल दोनों कैमरों के लिए एक ही विमान में निहित है, तो वे parfocal हैं. 3. इमेजिंग एक बार माइक्रोस्कोप के लिए सेट कर दिया जाता है, अगले काम के लिए प्रवाह युक्त गिलास समर्थित लिपिड bilayers पेश प्रतिजन और आसंजन अणुओं के रूप में पहले 6 वर्णित है और फिर ट्रांसफ़ेक्ट टी कोशिकाओं के साथ बातचीत TIRFM प्रदर्शन कक्षों को तैयार हैसब्सट्रेट. प्रकाशित bilayer 5-6 प्रोटोकॉल के रूप में है कि liposomes coverglass पर 20 मिनट के लिए नहीं incubated रहे के बाद प्रवाह कक्ष को इकट्ठा किया गया था के अलावा प्रकाशित किया गया था. इसके बजाय, HBS-BSA बफर विधानसभा के तुरंत बाद प्रवाह सेल में प्रवाहित किया गया था. तलीय लिपिड कांच कवर नी NTA लिपिड युक्त पर्ची पर गठित bilayers साथ एक प्रवाह कक्ष इकट्ठे. आसंजन अणुओं (100 अणुओं / माइक्रोन 2) ICAM 1, और पेप्टाइड MHC परिसरों, एमसीसी लोड IE कश्मीर (5-10 अणुओं / माइक्रोन 2), उनके हिस्टडीन टैग के माध्यम से bilayer में शामिल कर रहे हैं. costimulatory अणु CD80 जीपीआई लंगर (100 अणुओं / माइक्रोन 2) का उपयोग कर जोड़ा है. खुर्दबीन के मंच पर प्रवाह सेल प्लेस और इसे स्थिर. प्रवाह सेल पर हीटिंग तत्व इसके तापमान को नियंत्रित करने के लिए आपूर्ति निर्माता देते हैं. एक bilayer पर उद्देश्य स्थिति और bilayer विमान को ध्यान में लाने. सक्षम का उद्देश्य हीटिंग और प्रवाहसेल 37 पर चैम्बर के तापमान को स्थिर डिग्री सेल्सियस ट्रांसफ़ेक्ट टी कोशिकाओं की 80x जी और एक गति पर ऊष्मायन के 4 घंटे के बाद pelleted HBS-BSA बफर में फिर से निलंबित कर दिया और 10 / μg H57 फैब का एमएल या H57 एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) के 20 μg / एमएल के साथ पूरक TCR लेबल. कोशिकाओं तो प्रवाह कोशिकाओं में इंजेक्ट कर रहे हैं. इमेजिंग फैब या scFv अपने उच्च पृथक्करण निरंतर के कारण की निरंतर उपस्थिति में किया जाता है. मध्यम में उनकी उपस्थिति काफी पृष्ठभूमि में वृद्धि नहीं करता TIRF क्षेत्र के रूप में बहुत पतली है. इमेजिंग शर्तों को सेट कर रहे हैं ताकि दोहरी चैनल रहते अधिग्रहण TCR और GFP चैनलों की एक जीवित पूर्वावलोकन दिखाता है कि ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए खोज में मदद करता है. TIRF रोशनी कांच विमान ध्यान केंद्रित करने के लिए किसी भी पार्श्व झिल्ली धुंधला का पता लगाने के द्वारा पुष्टि की है. यदि पार्श्व झिल्ली ध्यान में नहीं आते हैं तो TIRF संरेखण अच्छा है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं तो एक या एक छवि अनुक्रम में है imaged लिए vid उत्पादनeos. 4. इमेज प्रोसेसिंग और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक ही फ्रेम में दो कैमरे से छवियों को outputs. प्रत्येक कैमरे के उत्पादन में 512 x 512 पिक्सल है, इसलिए, उत्पादन छवि आकार 1024 x 512 पिक्सल है. छवियों पहले व्यक्ति दो कैमरों के लिए इसी फ्रेम में विभाजित किया जाना चाहिए. दो चैनलों से उप संकल्प मोतियों की छवियों को आच्छादित कर रहे हैं और संरेखण पैरामीटर निर्धारित कर रहे हैं. हमारी प्रणाली के लिए विशिष्ट सुविधा 1 दूसरे के लिए सम्मान के साथ एक चैनल की डिग्री रोटेशन (चित्रा 3 देखें). इस रोटेशन के सबसे अधिक संभावना स्रोत कैमरा खड़ा है. इस रोटेशन के बाद एक्स और वाई में आगे सापेक्ष रैखिक परिवर्तनों के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता को पूरी तरह से एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ मोती संरेखित करें. मोतियों की छवियाँ हर दो चैनलों पंक्ति सटीक मानकों का निर्धारण करने के लिए प्रयोग में प्राप्त कर रहे हैं. ये रैखिक और घूर्णी परिवर्तनों को फिर से सभी के लिए लागू कर रहे हैंछवियों और फिर वे विभाजन एल्गोरिदम और सह स्थानीयकरण विश्लेषण के अधीन हैं. 5. प्रतिनिधि परिणाम यहां वर्णित प्रणाली प्लाज्मा झिल्ली में किसी भी रिसेप्टर के संकेत अनुप्रवाह अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह विशेष रूप से TCR संकेत अध्ययन में जानकारीपूर्ण है क्योंकि संकेत ऑप्टिकली हल बुलाया समूहों TCR microclusters या endosomes के रूप में हाल ही में 18 में वर्णित होता है. यदि संकेत रिसेप्टर्स की उप संकल्प समूहों में या संयुक्त राष्ट्र क्लस्टर रिसेप्टर्स में हुई अतिरिक्त प्रयोगों करने के लिए डेटा की व्याख्या करने के लिए किया जा करना होगा. जैसा कि पहले उल्लेख किया है, CD3 TCR जटिल श्रृंखला TCR की पेप्टाइड MHC परिसरों से सगाई पर LCK एसआरसी परिवार kinase द्वारा phosphorylation गुजरना. phosphorylated CD3ζ श्रृंखला तो SYK परिवार Zap70 kinase रंगरूटों. Za की भर्ती visualizing केp70 इस प्रकार CD3ζ श्रृंखला की phosphorylation की स्थिति पर रिपोर्ट. TCR उत्तेजना की ताकत TCR संपर्क अवशेषों में उत्परिवर्तित पेप्टाइड्स का उपयोग करके बदला जा सकता है. ऐसे पेप्टाइड्स बदल पेप्टाइड ligands (APLs) कहा जाता है. एक प्रतिनिधि प्रयोग चित्रा 4 जहां agonist के पेप्टाइड्स विवेकशीलतापूर्वक है TCR microclusters के लिए Zap70 रंगरूटों जबकि कम शक्ति पेप्टाइड T102L TCR microclusters Zap70 भर्ती, प्रदर्शन है कि इस मामले में CD3ζ श्रृंखला phosphorylated नहीं है विफल रहता है में दिखाया गया है. हम इस निष्कर्ष आकर्षित क्योंकि हम अभी Zap70 की है कि आसानी से TIRFM द्वारा पाया गया TCR समूहों के लिए भर्ती का निरीक्षण किया था सकता है. एक स्वचालित विभाजन एल्गोरिथ्म सेल के प्रति Zap70 microclusters की संख्या गिनने के लिए इस्तेमाल किया गया था. भी अनुपूरक फिल्म में दिखाया है TCR और Zap70 जुड़े प्रतिदीप्ति के साथ – साथ इमेजिंग. Lamelipodium की गतिशील प्रकृति नोट. <br /> चित्रा 1 छवि और कस्टम TIRF लांच की योजनाबद्ध. पैनल TIRF लांच की तस्वीर खुर्दबीन पर स्थापित के रूप में दिखाता है, और पैनल बी TIRF प्रकाश पथ प्रदर्शन के शुभारंभ के एक योजनाबद्ध है. योजनाबद्ध और छवि कलेक्टर लेंस, बीम फाड़नेवाला, एक्स, वाई और जेड समायोजन, collimating लेंस L1, और ध्यान केंद्रित लेंस L2 के साथ फाइबर शुभारंभ dichroic घन और TIRF उद्देश्य में स्थापित की स्थिति दिखा. इनसेट dichroic क्यूब में स्थापित लेंस ध्यान केंद्रित से पता चलता है. चित्रा 2 छवि और दो ​​कैमरा प्रणाली की योजनाबद्ध. पैनल एक के रूप में खुर्दबीन से जुड़ी दो कैमरा प्रणाली की तस्वीर दिखाता है, और पैनल बी उसी के एक योजनाबद्ध है. योजनाबद्ध और छवि दिखाने के उद्देश्य की स्थिति, दर्पण, dichroic, ट्यूब लेंस TL1 और TL2, उत्सर्जन फिल्टर F1 और F2, दो कैमरों C1 और टी सी 2वारिस उनके संबंधित एक्स, वाई और जेड के समायोजन के साथ खड़ा है. चित्रा 3. उप संकल्प मोती के प्रयोग के लिए दो चैनलों संरेखित करें. पैनलों संरेखण ए और बी उप संकल्प मोती के पहले शो ओवरले (पैनल एक) और (पैनल बी) के बाद. एक पैनल से पता चलता है कि एक चैनल के एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ घुमाया जा रहा है. पैनलों सी और डी छवियों का एक उप खंड में ए और बी पैनल ई प्रसंस्करण के बिना कोशिकाओं के एक दो चैनल उपरिशायी छवि से पता चलता है. पैनल विकास में इस्तेमाल किया संरेखण पैरामीटर पैनल एफ सूचना कैसे दो चैनलों से lamelipodium पैनल एफ में पूरी तरह से गठबंधन किया है और नहीं पैनल ई. सभी पैनल के लिए स्केल बार 4 माइक्रोन में दिखाया छवि के लिए लागू किया गया. चित्रा 4 अलग APLs के जवाब में Zap70 भर्ती से TCR microclusters तक. में इन विट्रो सक्रिय और टी कोशिकाओं एक प्लाज्मिड Zap70 एन्कोडिंग के GFP के लिए जुड़े हुए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गए थे और को कांच समर्थन नी NTA के 6 अणुओं / माइक्रोन 2 पेप्टाइड युक्त bilayers पर incubated कश्मीर उनके टैग आईई, 100 अणुओं / 2 उनका टैग Alexa647 संयुग्मित की माइक्रोन भरा हुआ ICAM 1 और 100 के अणुओं / CD80 जीपीआई – लंगर 2 माइक्रोन. लोड पेप्टाइड्स इनसेट में संकेत कर रहे हैं. 1-ICAM 100 अणुओं / माइक्रोन 2 एलेक्सा-647 संयुग्मित उनकी टैग ICAM-1 युक्त bilayers पर कक्षों को संदर्भित करता है. दोहरी चैनल युगपत अधिग्रहण TIRF माइक्रोस्कोपी Alexa546 संयुग्मित H57 फैब टुकड़ा (गैर अवरुद्ध) TCR दाग की निरंतर उपस्थिति में किया गया था. कोशिकाओं को bilayer साथ आरंभिक संपर्क के बाद एक घंटे के लिए imaged थे. सेल के प्रति Zap70 समूहों की संख्या एक स्वचालित क्लस्टर गिनती सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण किया गया. प्रत्येक मामले में कम से कम 40 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया. सभी छवियों के लिए स्केल बार दो माइक्रोन. / 92/3892fig5.jpg "> 5 चित्रा दो कैमरा प्रणाली का उपयोग करते हुए कैमरों के दो अलग अलग प्रकार के संतुलन. इस पैनल से पता चलता है उप संकल्प मोती के गठबंधन उपरिशायी दो कैमरा प्रणाली है, जहां दो कैमरों अलग पिक्सेल आकार (ग्रीन: 6.45 माइक्रोन पिक्सेल 2×2 binning और लाल पर है imaged आकार: 16 माइक्रोन पिक्सेल आकार नहीं binning में imaged किया) का उपयोग imaged किया. इनसेट क्षेत्र के केंद्र में वर्ग बॉक्स के आवर्धित दृश्य दिखाता है. स्केल बार 5 माइक्रोन. अनुपूरक मूवी agonist के पेप्टाइड के जवाब में Zap70 भर्ती TCR microclusters. में इन विट्रो सक्रिय टी कोशिकाओं एक प्लाज्मिड Zap70 एन्कोडिंग के GFP के लिए जुड़े हुए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गए थे और को कांच समर्थित नी NTA 6 अणुओं / माइक्रोन 2 पेप्टाइड युक्त bilayers पर incubated कश्मीर उनके टैग आईई, 100 अणुओं / माइक्रोन Alexa647 की 2 भरा हुआ जीपीआई – लंगर CD80 के संयुग्मित ICAM-1 और 100 / अणुओं 2 माइक्रोन उनकी टैग. दोहरी चैनल एक साथcquisition TIRF माइक्रोस्कोपी Alexa546 संयुग्मित H57 फैब टुकड़ा (गैर अवरुद्ध) TCR दाग की निरंतर उपस्थिति में किया गया था है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के एक क्षेत्र को बार – बार 10 फ्रेम प्रति सेकंड के समय संकल्प के साथ 40 बार imaged किया. स्केल बार 2 माइक्रोन. अनुपूरक फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

हम यहाँ करने के लिए एक प्रतिजन विशिष्ट प्राथमिक माउस TIRFM और कांच कृत्रिम APCs के रूप में लिपिड bilayers समर्थित का उपयोग टी कोशिकाओं में संकेत अध्ययन प्रणाली का वर्णन. तकनीक सफलतापूर्वक इन कोशिकाओं में व्यक्त GFP टैग प्रोटीन पर निर्भर करता है. टी कोशिकाओं Transfecting हमेशा एक चुनौतीपूर्ण काम है. आमतौर पर, electroporation या जीन वितरण रेट्रोवायरस या lentiviruses का उपयोग किया जाता है. एक दूसरे से बेहतर तकनीक नहीं है, दोनों अपनी सीमाओं और लाभ है. हम पाते हैं कि electroporation निम्न लाभ हैं: 1) यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से रेट्रोवायरस लेकिन lentiviruses नहीं के रूप में के लिए आवश्यक है विभाजित किया जा नहीं है, और 2) अभिव्यक्ति के स्तर समय कोशिकाओं इमेजिंग से पहले incubated हैं अलग से नियंत्रित किया जा सकता है. सबसे बड़ा दोष यह है कि हम यह बहुत मुश्किल है व्यक्त करने के लिए प्रोटीन है कि प्राथमिक कोशिकाओं में आकार में बड़े हैं लगता है. हम एक तरीका है कि हमें electroporation के बाद बहुत अच्छा सेल व्यवहार्यता देता प्रस्तुत किया है. नतीजतन यह applicab हैयह का उपयोग करने के लिए siRNA मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने को प्राप्त करने के लिए ले.

हम भी एक स्वनिर्धारित दो चैनल युगपत अधिग्रहण TIRF माइक्रोस्कोप है कि वार्णिक रूप से सही है और विभिन्न तरंगदैर्य के लिए अलग संरेखण की आवश्यकता नहीं है का वर्णन है. इन क्षमताओं, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. हमारी प्रणाली के क्षेत्र में विशेषज्ञों द्वारा प्रकाशित है और वाणिज्यिक विकल्पों की तुलना में सस्ता है TIRF माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों पर आधारित है. हमारे डिजाइन की आलोचना संभव है कि हम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए अलग घटनाओं के एक ही कोण का उपयोग कर रहे हैं. इस विभिन्न उत्तेजना तरंगदैर्य के लिए एक अलग TIRF प्रवेश गहराई में नतीजा होगा. हमें लगता है कि इन प्रभावों छोटे हैं क्योंकि क्षणभंगुर लहर तेजी से खस्ताहाल क्षेत्र है और TIRF क्षेत्र की गहराई तरंग दैर्ध्य के एक रेखीय समारोह है. कांच की सतह के करीब fluorophores दो तरंग दैर्ध्य के बीच लेजर की तीव्रता में कोई अंतर का अनुभव होगा. पे निकट fluorophores के लिएnetration गहराई, तीव्रता अंतर दो दो तरंग दैर्ध्य 488 और 561 एनएम के लिए 488 और तरंगदैर्य 640 एनएम और 1.15 गुना के लिए 1.3 गुना हो जाएगा. उसी प्रणाली कि TIRF रोशनी का उपयोग कर सुपर संकल्प तकनीक के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

हम भी एक दो कैमरा प्रणाली है जो कस्टम बनाया है वर्णित है. TIRF प्रणाली की तरह, इसी तरह apparatuses भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. हमारी प्रणाली लचीलापन प्रदान करता है फिल्टर और dichroics बदलने के लिए, तरंग दैर्ध्य के विभिन्न संयोजनों के साथ इसके उपयोग की अनुमति है. हमारे सिस्टम का दोष एक डिग्री रोटेशन के दो छवियों को संरेखित करने के लिए की जरूरत है. इस मुद्दे कैमरा खड़ा है कि piezo संचालित कर रहे हैं और संरेखण की घूर्णी डिग्री की पेशकश का उपयोग करके हल किया जा सकता है. हम भी सफलतापूर्वक इस खुर्दबीन पर एक दो कैमरा प्रणाली लागू की है, जिसमें कैमरों अलग हैं और अलग पिक्सेल आकार है. इस तरह एक प्रणाली उपयोगी हो सकता है अगर एक एक चैनल और एक बड़ी उप में संवेदनशीलता की जरूरतदूसरे में namic रेंज, दोनों जिनमें से शायद ही कभी एक ही कैमरा में उपलब्ध हैं. हम 2×2 binning पर Photometrics कैमरा मुख्यालय -2 हमें Photometrics कैमरा बल्ली से ढकेलना – EM जो 16 माइक्रोन का एक पिक्सेल आकार की है के साथ 12.9 माइक्रोन का एक प्रभावी पिक्सेल आकार देने है. एक 180 मिमी नाभीय लंबाई ट्यूब लेंस बल्ली से ढकेलना – EM के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक 145 मिमी नाभीय लंबाई ट्यूब लेंस कैमरा मुख्यालय-2 के लिए इस्तेमाल किया गया था. मुख्यालय 2 Metamorph सॉफ्टवेयर और बल्ली से ढकेलना EM-सूक्ष्म प्रबंधक सॉफ्टवेयर के माध्यम से बाहरी ट्रिगर मोड में एक अलग कंप्यूटर पर नियंत्रित किया गया था का उपयोग करते हुए नियंत्रित किया गया. बाहरी ट्रिगर बल्ली से ढकेलना EM-कैमरा माप कंप्यूटिंग डैक बोर्ड है, जो Metamorph कॉन्फ़िगर रोशनी सेटिंग्स में एक अतिरिक्त शटर के रूप में लागू किया गया था की एक डिजिटल उत्पादन का उपयोग करने के लिए प्रदान किया गया. ट्यूब लेंस के फोकल लंबाई के अनुपात प्रभावी पिक्सेल आकार के अनुपात से मेल खाता है. एक प्रतिनिधि संरेखण चित्रा 5 में दिखाया गया है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Amaxa Nucleofector Kit for Mouse T cells	Lonza Inc.	VPA-1006
PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit	Life Technologies	K2100-05	For endotoxin free DNA preps
Amaxa Nucleofector Device	Lonza Inc.	AAD-1001
Recombinant Murine IL-2	Peprotech Inc.	212-12
Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm	Polysciences, Inc.	24050-5
Lab-Tek II 8-well chambered coverglass	Thermo Scientific, Nunc	155409