En grundläggande protokollet för separation av DNA-fragment med användning av agarosgel-elektrofores beskrivs.
Agarosgelelektrofores är det mest effektiva sättet att separera DNA-fragment av varierande storlek som sträcker sig från 100 bp till 25 kb 1. Agaros isoleras från tång släktena Gelidium och Gracilaria, och består av upprepade agarobiose (L-och D-galaktos) subenheter 2. Under gelatinering, agaros polymerer associera icke-kovalent och bildar ett nätverk av buntar vars porstorlekar bestämma en gelens molekylsiktning egenskaper. Användning av agarosgelelektrofores revolutionerat separation av DNA. Innan antagandet av agarosgel, DNA främst separeras med sukros densitetsgradientcentrifugering, vilket bara gav en approximation av storlek. Att separera DNA med användning av agarosgel-elektrofores, är det DNA laddas in förtillverkade brunnar i gelén och en ström som påläggs. Fosfatryggraden i DNA (och RNA)-molekyl är negativt laddad, därför när den placeras i ett elektriskt fält, kommer DNA-fragment migrerar till positively laddade anoden. Eftersom DNA har en likformig massa / laddningsförhållande, är DNA-molekyler separeras med storlek inom ett agaros-gel i ett sådant mönster att det avstånd som tillryggalagts är omvänt proportionell mot logaritmen för molekylvikten 3. Den ledande modell för DNA-rörelsen genom en agaros-gel "förspänd reptation", varvid den främre kanten rör sig framåt och drar resten av molekylen längs 4. Graden av migration av en DNA-molekyl genom en gel bestäms av följande: 1) storleken på DNA-molekylen, 2) agaros koncentration, 3) DNA konformation 5, 4) spänning, 5) Förekomsten av etidiumbromid, 6) typ av agaros och 7) elektroforesbuffert. Efter separation kan DNA-molekylerna vara visualiserades under UV-ljus efter färgning med ett lämpligt färgämne. Genom att följa detta protokoll ska studenten kunna:
Agarosgel-elektrofores har visat sig vara en effektiv och effektivt sätt att separera nukleinsyror. Agaros s hög geistyrka möjliggör hantering av låga procentandelar geler för separation av stora DNA-fragment. Molekylsiktning bestäms av storleken på porerna som genereras av buntar av agaros 7 i gelmatrisen. I allmänhet gäller att ju högre koncentration av agaros, desto mindre porstorlek. Traditionella agarosgeler är mest effektiva vid separation av DNA-fragment mellan 100 bp och 25 kb. Att separera DNA-fragment större än 25 kb, kommer man att behöva använda pulsen elektrofores fält gel 6, vilket innefattar applicering av växelström från två olika riktningar. På så sätt större storlek DNA-fragment separeras genom den hastighet med vilken de omorientera sig med de förändringar i nuvarande riktning. DNA-fragment mindre än 100 bp mer effektivt separeras med användning av polyakrylamidgelelektrofores. Skillnadagarosgeler är polyakrylamidgel matrisen bildas genom en fri radikal drivna kemisk reaktion. Dessa tunnare geler är av högre koncentration, drivs vertikalt och har bättre upplösning. I modern DNA-sekvensering kapillärelektrofores används, varigenom kapillärrör är fyllda med en gelmatris. Användning av kapillärrör medger applicering av höga spänningar, vilket därigenom möjliggör separation av DNA-fragment (och bestämning av DNA-sekvensen) snabbt.
Agaros kan modifieras för att skapa låg smältpunkt agaros via hydroxietylering. Lågsmältande agaros används vanligen när isoleringen av separerade DNA-fragment önskas. Hydroxietylering minskar packningstäthet av agaros buntar, vilket effektivt minskar deras porstorlek 8. Detta innebär att ett DNA-fragment med samma storlek kommer att ta längre tid att förflytta sig genom en agarosgel med låg smältpunkt i motsats till en standard-agarosgel. Eftersom buntarna associera med varandragenom icke-kovalenta interaktioner 9, är det möjligt att åter-smälta en agarosgel efter att den har ställts in.
EtBr är den vanligaste använda reagenset för att färga DNA i agarosgeler 10. När de utsätts för UV-ljus är elektroner i den aromatiska ringen i etidium molekylen aktiveras, vilket leder till frisättning av energi (ljus) som elektroner återgång till grundtillståndet. EtBr verkar genom inskjutande sig i DNA-molekylen i en koncentrationsberoende sätt. Detta medger en uppskattning av mängden DNA i en viss DNA-band baserat på dess intensitet. På grund av sin positiva laddning, minskar användningen av EtBr hastigheten DNA migration med 15%. EtBr är en misstänkt mutagent och cancerframkallande, därför måste man iaktta försiktighet vid hantering av agarosgeler som innehåller det. Dessutom är EtBr betraktas som farligt avfall och måste tas om hand på lämpligt sätt. Alternativa fläckar för DNA i agarosgeler inkluderar SYBR Gold, SYBR grön, Crystal Violet och metyl Blue. Av dessaMetyl Blue och kristallviolett kräver inte exponering av gelén för UV-ljus för visualisering av DNA-band, vilket minskar sannolikheten för mutation om återvinning av DNA-fragmentet från gelén önskas. Emellertid deras känslighet är lägre än den för EtBr. SYBR guld och SYBR gröna är båda mycket känsliga och UV beroende färgämnen med lägre toxicitet än EtBr, men de är betydligt dyrare. Dessutom är alla de alternativa färgämnen antingen inte kan vara eller inte fungerar bra vid tillsats direkt till gelén, varför gelén måste vara post färgades efter elektrofores. På grund av kostnader, användarvänlighet, och känslighet förblir EtBr fortfarande färgämnet i valet för många forskare. Dock i vissa situationer, exempelvis när farligt avfall är svår eller när unga studenter utför ett experiment, kan en mindre giftiga färgämnen att föredra.
Lastning färgämnen som används i gel-elektrofores tjäna tre huvudsyften. Först lägger densitet på provet, Så att den kan sjunka in i gelén. För det andra färgämnen ge färg och förenkla lastning. Slutligen färgämnen rör sig standardpriser genom gelén, vilket för uppskattning av avståndet att DNA-fragment har migrerat.
De exakta storlekar av separerade DNA-fragment kan bestämmas genom plottning av logaritmen av molekylvikten för de olika banden av en DNA-standard mot avståndet som tillryggalagts av varje band. Den DNA-standard innehåller en blandning av DNA-fragment av förutbestämda storlekar som kan jämföras mot de okända DNA-prover. Det är viktigt att notera att olika former av DNA röra sig genom gelén vid olika hastigheter. Superspiralvriden plasmid-DNA, på grund av dess kompakta konformation, rör sig genom gelén snabbast, åtföljt av en linjär DNA-fragment av samma storlek, med den öppna cirkulära formen färdas den långsammaste.
Sammanfattningsvis, då det att agarosgeler under 1970 för separation av DNA, har detvisat sig vara en av de mest användbara och mångsidiga tekniker i biologi forskning.
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
Agarose I | Amresco | 0710 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
EDTA | Sigma | E9884 | |
Ethidium bromide | Sigma | E7637 | Carcinogenic-needs to be disposed of as hazardous waste |
Glacial acetic acid | Fisher | BP2401-212 | Corrosive |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Tris base | Sigma | T1503 | |
Investigator/FX gel documentation system | Fotodyne | ||
Owl Easycast B1 mini gel electrophoresis system | Thermo Scientific | B1-PTM | |
EPS 301 power supply | GE Healthcare | 18-1130-01 |