Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

1. Herstellung des Gels

1. Abwiegen die entsprechende Masse an Agarose in einen Erlenmeyerkolben. Agarosegele werden unter Verwendung von w / v Prozentsatz Lösung. Die Konzentration der Agarose in einem Gel wird auf der Größe der DNA-Fragmente abhängen, getrennt, wobei die meisten Gele im Bereich zwischen 0,5% -2% beträgt. Das Volumen des Puffers sollte nicht größer sein als 1/3 der Kapazität des Kolbens.
2. In Laufpuffer der Agarose-enthaltenden Flasche. Schwenken Sie zum Vermischen. Die häufigste Gel Laufpuffer sind TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) und TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA).
3. Schmelzen Sie die Agarose / Puffer-Mischung. Dies wird am häufigsten durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen durchgeführt, kann aber auch über einen Bunsenbrenner durchgeführt werden. Bei 30 s-Intervallen, entfernen Sie den Kolben und schwenken, um den Inhalt gut mischen. Wiederholen, bis die Agarose vollständig gelöst hat.
4. In Ethidiumbromid (EtBr) auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml. Alternativ kann das Gel auch nach elektro gefärbt werdenphorese in Laufpuffer enthält 0,5 mg / ml EtBr für 15-30 min, von Entfärben in Laufpuffer für eine gleich lange Zeit an.

Hinweis: EtBr ist im Verdacht, krebserzeugend und müssen fachgerecht pro Institution Vorschriften entsorgt werden. Handschuhe sollten immer getragen beim Umgang mit EtBr-Gele werden. Alternative Farbstoffe für die Färbung von DNA zur Verfügung, jedoch EtBr bleibt die beliebteste aufgrund seiner Empfindlichkeit und Kosten.

5. Lassen Sie die Agarose, um entweder auf dem Labortisch oder durch Inkubation in einem 65 ° C warmes Wasserbad abkühlen. Andernfalls wird verziehen den Gelträger.
6. Setzen Sie den Gelträger in die Gießvorrichtung. Alternativ kann man auch kleben die offenen Kanten eines Gelträger, um eine Form zu erzeugen. Setzen Sie einen geeigneten Kamm in das Gel Form, um die Brunnen zu schaffen.
7. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Gelform. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur eingestellt. Nehmen Sie den Kamm und legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer. Alternativ kann die gel kann auch in Folie eingewickelt und bei 4 ° C bis zur Verwendung (1).

2. Einrichten von Gel-Apparatur und Trennung von DNA-Fragmenten

1. In Ladepuffer zu den DNA-Proben zu trennen (Abb. 2). Gel Ladungsfarbstoff wird typischerweise bei 6X Konzentration (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol, 30% Glycerin) hergestellt. Lädt Farbstoff hilft Ihnen wieder, wie weit Ihre DNA-Probe gereist, und ermöglicht auch die Probe in das Gel zu versenken.
2. Programm die Stromversorgung gewünschte Spannung (1-5V/cm zwischen den Elektroden).
3. In genug läuft, Puffer, um die Oberfläche des Gels bestimmt. Es ist wichtig, um die gleiche Laufpuffer wie die zur Herstellung des Gels verwendet.
4. Befestigen Sie die Kabel des Gel-Box an die Stromversorgung. Schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie sicher, dass sowohl Gel Box und Stromversorgung arbeiten.
5. Nehmen Sie den Deckel. Langsamund sorgfältig zu laden die DNA-Probe (n) in das Gel (Abb. 3). Eine entsprechende DNA-Größenmarker sollte immer zusammen mit experimentellen Proben beladen werden.
6. Setzen Sie den Deckel auf die Elektrophoresekammer. Die Kathode (schwarze Leitungen) sollte näher sein als die Brunnen der Anode (rote Leitungen). Überprüfen Sie, dass die Elektroden in die richtigen Schlitze in der Stromversorgung angeschlossen sind.
7. Schalten Sie die Stromversorgung. Führen Sie das Gel, bis der Farbstoff zu einem angemessenen Abstand migriert wurde.

3. Beobachten aufgetrennten DNA-Fragmente

1. Wenn Elektrophorese beendet ist, schalten Sie die Stromversorgung und entfernen Sie den Deckel der Elektrophoresekammer.
2. Entfernen Gel aus dem Gel Box. Überschuss ablaufen lassen Puffer von der Oberfläche des Gels. Setzen Sie den Gelträger auf Küchenpapier, jede zusätzliche Laufpuffer absorbieren.
3. Entnehmen Sie das Gel aus dem Gel Tray und setzen Sie das Gel mit UV-Licht. Dies wird meist geschieht mit Hilfe eines Gel-Dokumentations-System (Abb. 4). DNA-Banden soll zeigen,als orange fluoreszierenden Bändern. Machen Sie ein Foto des Gels (Abb. 5).
4. Entsorgen Sie die Gel-und Laufpuffer pro Institution behördlichen Vorschriften entsorgen.

4. Repräsentative Ergebnisse

5 zeigt ein typisches Ergebnis nach einer Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten. Nach der Trennung werden die erhaltenen DNA-Fragmente sichtbar klar definierten Bands. Die DNA-Standard oder einer Leiter sollte auf ein Maß, das für den nützlichen Bestimmung der Größe der Stichprobe erlaubt Bands getrennt werden. In dem gezeigten Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 bp, 880 bp und 1022 bp auf einem 1,5% Agarosegel mit einem 2-log-DNA-Leiter getrennt.

1. Eine erstarrte Agarosegel nach der Entfernung des Kamms.

Abbildung 2. Eine Studentin und fügt Ladefarbstoff ihr DNA-Proben.

Abbildung 3. Ein Student Laden der DNA-Probe in einen Brunnen im Gel.

4. Ein Beispiel für ein Geldokumentationssystem.

Bild 5. Ein Bild von einem Gel nach der Elektrophorese. EtBr wurde an das Gel vor der Elektrophorese in einer Endkonzentration von 0,5 mg / ml, durch Trennung bei 100 V für 1 Stunde zugegeben, gefolgt. Das Gel wurde mit UV-Licht und das Bild mit einem Gel-Dokumentations-System übernommen ausgesetzt.

Wir haben nichts zu offenbaren.