Denna metod användes i forskningen rapporterades i Boland et al. Nature. 461, 91-96 (2009). 1 1. Framställning av Lentivirus Detta protokoll använder doxycyklin-inducerbara lentivirala skyttelvektorer som kodar för Oct4, Sox2, Klf4, och c-Myc under kontroll av en tetO svarselement. Transgener aktiveras av den omvända tetracyklin trans-aktiverande protein, rtTAM2.2 16, vilket inducerar omprogrammering faktor expression i närvaro av doxycyklin. Detta system möjliggör hårt kontrollerad, högt uttryck av omprogrammering faktorer. De lentivirala vektorer som används här är själv-inaktiverande och därmed inte kan replikera följande genomisk integration. Men krävs försiktighet vid arbete med lentivirus och bör utföras i laboratorier uppfyller BSL2 (USA) och S2 (Europa) normer. Tina HEK293T celler och passage minst en gång innan transfection. Cellerna bör hållas vid subkonfluent densitet i HEK-medium vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktad miljö. Rutinmässigt passage celler var 2 dagar med en delad förhållande 1:06 till 01:10. Seed ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 med 25 ml HEK medium. Använd en T150 för varje lentivirus preparat. Följande dag transfektera HEK293T-celler genom kalciumfosfatutfällning. (Obs! i våra händer kalciumfosfatutfällning rutinmässigt ger 80-90% transfektionseffektivitet, men kan katjoniska lipid transfektion reagens såsom Lipofectamine 2000 också användas). Förbered två 15 ml koniska rör för varje virus att vara förberedd. Märk rören "A" och "B". Rör A, 10 ^ g av var och en av: de lentivirala skyttelvektor kodar omprogrammering faktorer (eller rtTAM2.2), de virala vektorerna förpackningar, och plasmid som kodar för virala höljesproteinet, VSVG. Lägg 186 ul 2 M CaCl 2 i rör A och föra volymen till 1,5 ml med sterilt H 2 O. Rör B: 1,5 ml 2X HBS (förvärmd till rumstemperatur). Pipettera blandningen i röret A tills den är en homogen lösning. Lägg lösning A till lösning B droppvis och låt stå vid rumstemperatur under 2-3 min. Aspirera tillväxtmedium HEK293T celler och ersätta med 22 ml förvärmd HEK-medium utan penicillin och streptomycin. Pipettera kombinerade lösningarna AB (kalciumfosfat fällning) direkt till HEK293T celler och fördela jämnt genom försiktig skakning. 24 timmar efter transfektion av HEK-293T-celler med lentivirus, avlägsna tillväxtmedium och ersätta den med 25 ml färskt, förvärmd HEK-medium. Återgå transfekterade Heks till inkubatorn. 48 timmar efter transfektion av HEK-293T-celler med lentivirus, samla odlingsmedia innehållande lentivirala partiklar från de transfekterade Heks. Avlägsna partikelformigt skräp från den skördade virala lösningen genom centrifugering vid 3.000 x g under 5 min vid 4 ° C. Koncentrera viruset genom ultracentrifugering through en 20% sackaroskudde (2 ml sucrose/25 ml viral supematant) under 2 h vid 112.000 xg vid 4 ° C. Suspendera virala pelleten i 0,4 ml MEF-medium vid 4 ° C under 15-30 minuter med försiktig skakning. Förvara virala partiklar i engångsbruk alikvoter (dvs. 50 | il) vid -80 ° C. 2. Beredning av Mouse Embryonala fibroblaster (MEF) för omprogrammering Obs: det protokoll som beskrivs här avser att härleda iPSCs från E 13,5 mus embryonala fibroblaster för användning i TEC-analyser. Även andra grupper har genererat helt IPSC möss från vuxna källor givarcell har vi inte testat metoden på andra celltyper och kan inte vara säker på att givare celltyp är inte en faktor. Ställ in mus tidsinställda parningar. På embryonal dag 13,5 (E13.5), avliva den dräktiga honan och dissekera embryon från livmoderhornen. Plats och embryon lagra i 1x PBS (före kyld till 4 ° C) på is. Ta bort extraembryonic vävnader (dvs.korion, amnion och moderkakan). Halshugga embryot och ta bort svansen (tillval – om det behövs för genotypning) och lemmar. Gröp ur inre organ, med hjälp av pincett eller en skopa formad spatel och finhacka resten stomme med bladet av en skalpell eller vass sax. Tvätta det malda stommen i 5 ml i förväg kyld 1x PBS. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. Aspirera supernatanten. Suspendera pelleten i 5 ml 0,25% trypsin-EDTA och inkubera vid 37 ° C under kraftig skakning under 20-30 min. Tillsätt 5 ml av MEF-medium (förvärmd till 37 ° C), blanda och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Sug supernatanten och återsuspendera pelleten i förvärmd MEF medium. Platta dissocierat MEF i 2-3 brunnar av en 6-brunnsplatta förbelagd med 0,1% gelatin. Detta anses passagen 1. Passage MEF vid en utspädning av 1:04 till 1:05 var 48 timmar. MEF vid passage 3 är redo för Lentiviral transduktion. 3. Härledning av IPSC Lines Dagen före transduktion Lentiviral, utsäde ~ 3 x 10 5 primär MEF i en brunn i en 6-brunnsplatta förbelagd med 0,1% gelatin. Dag 1: Primär MEF ska vara 80-90% konfluenta för Lentiviral transduktion. Lägg lentivirala partiklar direkt till MEF media och inkubera med MEF natten vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktad miljö. Följande dag (dag 2) aspirera mediet och tvätta två gånger med 3 ml 1 x PBS för att avlägsna viruspartiklar. Tillsätt 0,5 ml förvärmd 0,25% trypsin-EDTA till cellerna och inkuberas vid 37 ° C under 3-5 minuter med sporadisk skakning. Finfördela att uppnå en enkel-cellsuspension. Observera celler med Ijusmikroskopi för att säkerställa en enkelcellsuspension. Överför MEF i ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml medium MEF. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. Aspirera supernatanten och försiktigt återsuspendera celler i MEF-medium. Jämnt fördelade cellsuspensionen mellan två brunnar av en 6 väl psen förbelagd med 0,1% gelatin. Rock plattan fram och tillbaka, från sida till sida, och en gång i en cirkulär rörelse för att uppnå en jämn fördelning av celler genom hela brunnen. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktad miljö. Dag 3: Upprepa steg 4-9 med undantag dela cellerna jämnt från en brunn till 3 brunnar i en 6-brunnsplatta förbelagd med 0,1% gelatin. Detta kommer att ge 6 brunnar av transducerade primära fibroblaster. Dag 4: Lägg doxycyklin (DOX) vid en koncentration av 10 pg / ml till 5/6 brunnar. En brunn bör förbli obehandlade för att tjäna som en kontroll. Lägg VPA vid 1,9 mM till 3 av de 5 brunnarna som behandlats med DOX. VPA minskar spridningen andelen MEF. Täta kulturer av MEF tolerera långvarig exponering för VPA, medan subkonfluenta kulturer tenderar att åldras inom 2-5 dagar. Därför bör MEF vara 100% sammanflytande vid VPA tillsätts. Obs: Vi använder VPA i våra omprogrammering experiment eftersom det är ett känt epigenetisk modifierare, och har varit shegna för att öka effektiviteten i IPSC generationen 17 även om effekterna och mekanismer för VPA åtgärder med avseende på att generera fullt pluripotenta IPSC linjer inte är kända. Dag 5: Sug mediet, tvätta och Trypsinisera cellerna som tidigare. Passage av cellerna behandlade med dox / VPA till en 15 cm 2 vävnadsodlingsskål förbelagda med 0,1% gelatin och vardera av de övriga villkoren för förbelagda 10 cm 2 rätter i ES-cell-medium kompletterat med färsk DOX och VPA. Fyll celler varje dag med ESC-medium kompletterat med färsk DOX och VPA. ESC-liknande kolonier bör börja visas efter ~ 7 dagar i DOX / VPA behandling och efter ~ 10 dagar i DOX ensam behandling. Inga kolonier ska visas i frånvaro av DOX behandling. När kolonier har en ljus refraktiv, väldefinierade gränsen och innehåller 30-50 celler, manuellt isolera kolonier med en gel-laddning pipettspets och överföring till en U-bottnad 96 brunnars platta innehållande 20 | il av 00,25% trypsin-EDTA. Trypsinisera till enstaka celler och överföra till matare i en flatbottnad 96 brunnsplatta i 150 ul ESC medium innehållande DOX / VPA eller DOX ensam. Fortsätt att klonalt expandera de isolerade IPSC linjerna på matare i ESC-medium. Ta dox och VPA på dag 19 efter tillsättningen (efter transduktion dag 23). Kasta IPSC linjer som inte upprätthåller självförnyelse eller priser spridning liknar ESC kontroller. Det kan vara till hjälp för att karakterisera din IPSC linjer i förhållande till ekonomiska och sociala råd innan du försöker utföra EG-fördraget. Vi har karakteriserat våra linjer av 1) uttryck av endogena pluripotensbestämmande markörer (SSEA-1, Oct4, Sox2, nanog) genom immunocytokemi, 2) karyotyp analys av kromosom räkna och 3) embryoidkroppar kropp bildning. Man kan också utföra lentiviral-specifik RT-qPCR att bekräfta att de provirala transgener inte uttrycks i iPSCs. Vi har dock identifierat helt pluripotenta iPSCs med bara morfologi, immunfärgning och karyotypIng. I våra experiment, val av IPSC linjer baserat på ESC-liknande morfologi och egenskaper tillväxt resulterar i de flesta av de linjer som uttrycker pluripotensbestämmande markörer medan vi identifierar typiskt flera rader med potentiellt onormala karyotyper. 4. Beredning av iPSCs för Långtidsodling injektion Passage antal en PSC linje har visats påverka dess pluripotens 18 även om detta kan vara beroende linje 19. Vi har använt iPSCs av från passagerna 8-14 för att producera vuxna helt IPSC möss. Tina iPSCs och platta på matare i ESC medium. Passage cellerna minst en gång om matare före användning för injektion. En brunn i en 6-brunnars platta innehållande 70-80% konfluenta iPSCs kommer att ge mer än ett tillräckligt antal celler för injektion. Aspirera tillväxtmedium och tvätta cellerna med ~ 3 ml 1 x PBS (utan Ca 2 + / Mg 2 +). Tillsätt 0,5 ml förvärmd 0,05% trypsin-EDTA tillcellerna och inkubera vid 37 ° C under 10 min med tillfällig skakning. Finfördela att uppnå en enkel-cellsuspension. Observera celler med Ijusmikroskopi för att säkerställa en enkelcellsuspension. De iPSCs måste vara i enkelcellsuspension som kolonier / cellaggregat kommer att täppa till injektionspipetten. När en enda cellsuspension har ben uppnått, tillsätt 1,0 ml ESC media till brunnen och återföra plattan till 37 ° C inkubator. Inkubera ~ 15 min eller tills huvuddelen av matare har börjat att vidhäfta. Ta försiktigt bort mediet innehåller iPSCs noga med att inte rubba de svagt vidhäftande matare. Placera iPSCs i ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml ESC medium. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter. Aspirera supernatanten och avlägsna återstoden av ES-cell-medium med en mikropipett. Tryck röret att rubba pelleten och försiktigt återsuspendera celler i 0,2-0,5 ml i förväg kyld FHM medium. Lagra celler på is tills och under injektion i tetraploida Blastocysts. 5. Generering av tetraploida Blastocyster Granskningsåtgärder som vidtas i detta avsnitt har beskrivits i detalj på annat håll 5,6,20. Här redogör vi för vår teknik, optimerad för BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001. Ställ in möss embryo givare genom priming 23-28 dagar gamla honmöss (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) med PMS och HCG. Administrera 5 IE av PMS vid 14:00 och 5 IE HCG 47 timmar senare. Efter HCG injektion upprätta honmöss med C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 stud män. Kontrollera följande dag för vaginala pluggar. Avliva ansluten honmöss och samla äggledarna. Samla 1-cellembryon genom att placera äggledarna i FHM med hyaluronidas och försiktigt riva ampulae. Låt cumulus massorna att sitta i FHM / Hyaluronidas för 5-7 minuter. Samla 1-cellembryon med en mun pipett och tvätta igenom droppar FHM medier innan du placerar dem i KSOM-AA kultur. Kultur vid 37 ° C, 5% CO 2 i mineralolja natten och välj 2-cellembryon dagen elektrofusion, kassera alla andra embryon. Placera en BTX Microslide i en 10 cm petriskål. Häll tillräckligt rum medietemperatur elektrofusion att dränka bilden i lösningen, men inte så mycket att polerna av elektroden är helt under vatten. Slå på ECM 2001 och BTX Enhancer 400. Anslut ECM: s kablar till microslide s elektroden och fäst kablarna vid sidan av petriskålen för att förhindra oavsiktlig rörelse hos bilden. Kör en manuell puls för att få en läsning på BTX förstärkare och notera spänningen av AC / DC strömmar som tillämpas. Växelström kommer att kontrollera den hastighet med vilken embryona kommer att anpassa mellan elektroderna, kommer DC-ström smälta blastomererna, och pulstid ställer längden på DC-puls. En bra utgångspunkt är AC 3V DC 100V och tid 0,05 msek. Den optimala DC varierar i intervallet 90-150 volt. </li> Med hjälp av en mun pipett ca 30-40 två-cell embryon från KSOM-AA kultur och tvätta dem genom flera droppar elektrosvetsning medium. Rita färskt elektrofusion media från microslide skålen i munnen pipett och ta embryon från tvätten. Placera dem i 1 mm mellan elektroderna på microslide. Var noga med att de är inriktade i mitten av gapet och att de inte är i kontakt med varandra. Applicera växelström genom att trycka på manuella puls-knappen. Embryona kommer att rotera i AC-fältet, till dess plan blastomeren kontakt är parallellt med elektroderna. Om embryona inte är inriktade på några sekunder, ökar AC inställning. Efter embryon har anpassat trycker manuella puls igen för att tillämpa DC puls. Med elektrosvetsning medium i pipetten, samla embryon från microslide. Tvätta embryon genom flera droppar KSOM-AA och placera dem i KSOM-AA kultur vid 37 ° C, 5% CO 2. Den blastomer fusion should slutföras på mindre än 30 minuter i kultur. Upprepa steg 7-11 för kvarvarande 2-cellembryon. Efter efterföljande fusion grupper, övervaka och välj embryon med smält blastomerer. Framgångsrikt sammansmälta embryon ser ut att vara i 1-cell skede. Kasta lyserats och 2-cell embryon efter 30 min i kultur. Om fusion ligger under 80%, öka spänningen och / eller tid i steg om 5 V och 0,01 msek. Om lys är över 20%, minska likspänning och / eller tid därefter. De optimala inställningarna i våra experiment var AC 4V DC 146V och 0,07 msek. Dessa inställningar gav genomgående 90% eller högre fusion med liten eller ingen lys. Fortsätt att kultur smält embryon mikrodroppar av KSOM-AA enligt mineralolja vid 37 ° C, 5% CO 2. Du kan förvänta dig 85-95% av smält embryon att bilda tetraploida (4n) blastocyster efter 48 timmar av inkubation. 6. Mikroinjektion av iPSCs till tetraploida Blastocyster Vi använder en Nikon TE-2000Uinverterat mikroskop utrustat med DIC optik och Narishige mikromanipulatorer för blastocyst injektion. Varje tetraploid blastocysten injiceras med 10-12 iPSCs med ett standardprotokoll för ESC injektion i musblastocyster som har visats i en tidigare JUPITER publikation 5,20,21 Placera en 20 ul droppe FHM i mitten av en konkav objektglas och täck den med 150 ul mineralolja. Sänk innehav pipett och mikroinjektion nål i FHM droppe. Låt 2-3 minuter för båda nålar att delvis fylla med FHM. Tvätta 20-30 tetraploida blastocyster genom droppar av FHM och överföring till FHM droppe på objektglas. Mun pipett IPSC blandningen i nedgången. Det kan vara nödvändigt att späda cellblandningen i en droppe av FHM förväg om celler är alltför koncentrerad eller aggregeras. Plocka upp 100-200 celler med injektionsnålen. Håll blastocysten med den inre cellmassan i klockan 9 positjon. Injicera cellerna i blastocoel genom att penetrera zona pellucida och trofoblasten vid klockan 3. Injicera 16-18 celler per blastocyst. Återgå IPSC kompletterade blastocyster till KSOM-AA kultur. 7. Överföring av kompletterade tetraploida Blastocyster i de livmoderhornen Mottagarens Möss Kompletterade tetraploida blastocyster kirurgiskt överförs till livmodern horn kvinnliga mottagare möss enligt riktlinjerna för forskarens institution, med hjälp av standardteknik 20 som vi kort sammanfatta. Välj kvinnliga CD-1-möss på pro-estrus scenen och ställa upp dem för parning med vasektomiserade hanar. Kontrollera om vaginala pluggar nästa morgon. Honorna är redo för livmodern embryo två dagar efter kontakten upptäcktes (2,5 DPC). En dag innan mottagande honor paras med vasektomiserade hanar, skapa ytterligare cd-1 honor med icke-vasektomiserade hanaratt användas som fostermödrar för all-IPSC möss hämtas genom kejsarsnitt. 8. Kejsarsnitt och främjande av IPSC-härledda Valpar Överföringen av TC embryon resulterar typiskt i multipla resorption efter implantationen, även om IPSC eller ESC linje har en hög utvecklingspotential. Som ett resultat kan man inte förvänta sig mer än 4 livskraftiga valpar (vanligtvis 1-2) per mottagare. Dessa små kullar vanligen försummas av mottagarna. För att öka graden av neonatalvård och graden av överlevnad, utför vi C-sektioner och främja enligt standarden protokoll 20. För att utföra kejsarsnitt, avliva mottagande möss 16 dagar efter embryotransfer på 7-08:00 (mottagare 18,5 DPC) och dissekera valpar från livmoderhornen. Främja hållbara valpar till CD-1 mammor som levererade kullar samma dag.