彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞(IPSC)ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する<sup> 1</sup>。
体細胞から誘導多能性幹細胞(性IPSC)の生産は、基礎研究のための貴重なツールを作成する手段を提供し、また、再生治療のために患者をマッチさせた細胞の供給源を生成することがあります。性IPSCは、複数のプロトコルを使用して生成され、複数の細胞供給源に由来してもよい。一度生成された、性IPSCは、多能性マーカーの免疫染色、胚様体や奇形腫、胚性幹細胞(ESC)と生殖細胞系列への寄与2の有無にかかわらず、キメラマウスの作製と遺伝子発現の比較で三胚葉の生成を含む種々のアッセイを用いて試験する。重要なのは、これらのテストに合格IPSC線は依然として異なる分化細胞型2を製造する能力が異なります。これは難しいIPSC導出プロトコル、ドナー細胞ソースや選択方法が異なるアプリケーションのために最も有用である確立してきました。
最も厳しいテスト幹細胞株は、生物の生存に必要なすべての組織を生成するための十分な発生能を有するかどうかの(と呼ばれる完全な多能性)四倍体胚補完(TEC)3-5です。技術的には、TECは胚盤胞期6〜in vitroで培養することができる四倍体(4N)1細胞期胚を生成するには2つの細胞期胚の電気融合を伴います。二倍体(2n)の多能性幹細胞( 例えば ESCはまたは性IPSC)を四倍胚盤胞の胞胚腔に注入します( 図1を参照)妊娠のためのレシピエント雌に転送されます。二倍体細胞が注入された幹細胞株から完全に由来する胎児で、その結果、胚は適切な構成に対し、補完胚の四倍体成分は、胚体外組織(胎盤、卵黄嚢)にほぼ独占的に貢献しています。
最近、我々は再現性成体マウスを生成IPSC線の導出を報告テック1を介して。これらIPSC行はESCは3,4,7に匹敵すると、他のほとんどのIPSCライン8月12日のために報告されたものよりも高くなって、5から13パーセントの効率で実行可能な子犬を生じさせる。これらのレポートは、直接リプログラミングはTECテストで子犬を生成するの彼らの発達の可能性と効率性にESCを完全に一致させる多能性IPSCを作り出すことができることを示している。現時点では、それは完全に多能性IPSCの少ない強力なライン13から15の間で区別するものは明確ではありません。また、それは方法が最も効率的にこれらの行が生成されるリプログラミングは明らかである。ここでは、IPSC線の多能性を比較したり、別のプログラミング方法の同等性を確立しようとする研究者のために役立っているかもしれません完全に人工多能性IPSCと "all-IPSC"マウスを生成し、一つの方法を説明します。
TECのアッセイを用いて、IPSCラインからマウスを生成すると、IPSCラインの多能性のための厳しい機能テストを提供しています。このテストでは、異なるプログラミング方法の相対的な有効性を評価したり、 試験管内で特定の種類の細胞を生成するための最も有用であろうIPSC行を識別するために、役に立つかもしれません。性IPSCから生成されたマウスは厳しくIPSC由来の組織の長期安定性と発癌性をテストするために使用されるかもしれません。このプロトコルは、完全に多能性IPSC IPSC線やマウスを作製したり、別のプログラミング方法の相対的な効用を比較するために希望する研究者に有用であろう。
完全に多能性IPSCの発生と同定は十分に理解のまま、それがこの方法を用いて製造ラインが一部IPSC TEC試験に合格しない可能性があります制御メカニズム。多くの要因が遺伝的背景、レンチウイルス力価は、レンチウイルスのパターンiを含む実験の間で異なるかもしれませんnsertion、ドナー集団の細胞周期パラメータは、TECの手順の様々なステップと性IPSCの変数性癖で研究室間の違いは遺伝的またはエピジェネティックな異常を抱いています。最高の成功を確実にするために、我々はそれぞれのウイルスが十分に検出可能な遺伝子発現を少なくとも80%との理想的には100%を生産するために集中していることを保証するためにコントロールのMEFのウイルス希釈液をテストすることにより、IPSC導出実験におけるレンチウイルス遺伝子発現の適切な水準を確立するために世話をするMEFに。これは過密井戸なしでのMEFと生産コロニーへの毒性を制限しながら、私たちは異なるレンチウイルスの複数のコピーを持つ行を識別することができます。これは、複数の他のプロトコルが完全多能性への複数のパスが1,8-13,15が存在するかもしれないことを示唆する複数の方法やドナー細胞の光源を使用し、完全発達可能性を秘めた性IPSCを生成することが示されている点に留意する必要がある。しかし現在は、完全に多能性IPSCのない決定的なバイオマーカー識別され、それゆえのTECアッセイはIPSCラインは生物のすべての細胞系譜を生成できるかどうかのゴールドスタンダードテスト残っています。
The authors have nothing to disclose.
KKB、MJB、ジーザスライフハウスとKLNへのサポートは、カリフォルニア再生医療研究所、ピュー慈善トラストメディカル奨学金プログラム、エスター·B·オキーフファミリー財団とシャピロファミリー財団によって提供されました。 KKBはドナルドE.とデリアB.バクスター財団学部学者である。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM (high glucose) | Invitrogen | 11965-092 | |
ES cell qualified FBS | Invitrogen | 104392-024 | |
FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma | Sigma M7522 | |
0.1% Gelatin | Millipore | ES006-B | |
MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
Medium 199 | Invitrogen | 11150-059 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
ESGRO (murine LIF) | Millipore | ESG1106 | |
Valproic Acid | Sigma | P4543 | |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
PBS Ca2+/Mg2+ | Invitrogen | 14040-133 | |
PBS Ca2+/Mg2+ free | Invitrogen | 14190-144 | |
Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU | Harbor-UCLA Research Institute | n/a | |
Chorionic gonadotropin, human | Sigma | C1063 | |
FHM medium with Hyaluronidase | Millipore | MR-056-F | |
KSOM-1/2 AA medium | Millipore | MR-106-D | |
FHM | Millipore | MR-024-D | |
Water, for embryo transfer, embryo tested | Sigma | W1503 | |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M5310 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4 | Sigma | M2773 | |
D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
Bovine serum albumin (BSA), embryo tested | Sigma | A3311 | |
Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated | Millipore | PMEF-CFL | |
Media and buffers used in this protocol HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 °C for up to 1 month. 2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4·7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 °C. Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 °C for up to 1 month. ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 °C for up to three weeks. Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 °C for up to 3 months. |