Denne protokol beskrives anvendelsen af en tangentiel strømning hulfiber-ultrafiltrering prøvekoncentration system og en varme dissociation som alternative trin til påvisning af vandbårne<em> Cryptosporidium</em> Og<em> Giardia</em> Arter brug af EPA metode 1623.
Cryptosporidium og Giardia arter er to af de mest udbredte protozoer, der forårsager vandbårne diarré sygdomsudbrud på verdensplan. For bedre at karakterisere forekomsten af disse patogener, blev EPA metode 1623 udviklet og anvendt til at overvåge niveauer af disse organismer i USA drikkevandsforsyningerne 12. Metoden har tre hoveddele: den første er den prøvekoncentration, hvor mindst 10 L af rå overfladevand filtreres. Organismer og fanget rester derefter elueres fra filteret og centrifugeret for yderligere at koncentrere prøven. Den anden del af fremgangsmåden anvender en immunomagnetisk separation procedure, hvor den koncentrerede vand-prøve påføres immunomagnetiske perler, som specifikt binder til Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster muliggør specifik fjernelse af parasitter fra den koncentrerede debris. Disse (oo) cyster derefter adskilles fra de magnetiske perler med en syre dissociation procedure. Den sidste del af metoden er immunofluorescensfarvning og optælling hvor (oo) cyster anvendes på et dias, farves, og optælles ved mikroskopi.
Fremgangsmåden 1623 har fire angivne prøvekoncentration systemer til at fange Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster i vand: Envirochek filtre (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filtre (Pall Corporation), Filta-Max filtre (IDEXX, Westbrook, MA), eller Fortløbende Flow Centrifugering (Haemonetics, Braintree, MA). Imidlertid har Cryptosporidium og Giardia (oo) cyster inddrivelser varierede meget afhængigt af kilden vandet matrix og filtre anvendt 1,14. En ny tangential flow hulfiber-ultrafiltrering (HFUF) er for nylig blevet vist at være mere effektive og mere robust på genvinding Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster fra forskellige vand matricer, og desuden er det billigere end andre kapsel filters og kan koncentrere flere patogener samtidigt 1-3,5-8,10,11. Hertil kommer, viste tidligere undersøgelser af Hill og hans kolleger at HFUF væsentligt forbedret Cryptosporidium oocyster inddrivelser, når sammenlignes direkte med de Envirochek HV filtre 4. Yderligere modifikationer af de eksisterende metoder er også blevet rapporteret at forbedre metoden ydeevne. Erstatte syredissociations procedure med varme dissociation blev vist at være mere effektive til adskillelse Cryptosporidium fra de magnetiske perler i nogle matricer 9,13.
Denne protokol beskriver en modificeret metode 1623, der bruger det nye HFUF filtreringssystem med varmen dissociationstrinnet. Brugen af HFUF med denne ændrede metode er et billigere alternativ til de nuværende EPA-metode 1623 filtrering muligheder og giver mere fleksibilitet ved at tillade koncentrationen af flere organismer.
Tangential flow hulfiber-ultrafiltrering er en alternativ og effektiv teknik til den oprindelige koncentration af Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster fra vand. Hulfiber-ultrafiltrering er billigere end traditionelle filtre. Idet det har evnen til at koncentrere Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster fra en række forskellige vand matricer er et nyttigt alternativ til de nuværende filtreringsteknikker, der anvendes til EPA metode 1623. Som med de fleste andre filtreringsmetoder er hule fiber ultrafiltrering tilbøjelige til tilstopning med ekstremt uklare prøver. Højt vandtryk ville resultere fra filteret begroning, og derfor anbefales det at overvåge trykket under filtrerings-kørsel. Ud over Cryptosporidium-oocyster og Giardia cyster er hule fiber ultrafiltrering blevet vist at være i stand til at koncentrere bakterier og vira 1-3,5,8. Hulfiber-ultrafiltrering outlined ved denne fremgangsmåde kan anvendes til at koncentrere flere organismer i en enkelt prøve. Det er bemærkelsesværdigt, at opnå et endeligt volumen mellem 200 og 250 ml er den kritiske sidste trin i koncentrationen proceduren, således at ekstra centrifugeringstrin, der kan resultere i (oo) cyste tab undgås (trin 2.2). Men kan så lydstyrken i flasken til at falde for lavt have negative konsekvenser for de inddrevne beløb, da der ikke vil være nok væske volumen til at tvinge alle oocysterne eller cyster i retentatet flasken. Derfor anbefales det at opretholde et slutvolumen mellem 200 og 250 ml.
Varme dissociation er et alternativ til syredissociations trin i fremgangsmåde 1623. Denne alternative trin har vist sig at forbedre Cryptosporidium oocyst genvinding og reducerer fremgangsmåden variation, når isoleret fra enten flod-eller reagens vand 9. En side-ved-side sammenligning af syre og varme dissociations fremgangsmåder vist, at ved anvendelse af varme til dissociate organismer fra de immunomagnetiske perler fremstillet højere gennemsnitlig inddrivelser for både Cryptosporidium og Giardia. Desuden var præcisionen af Cryptosporidium og Giardia genfindelse bedre i prøver der er behandlet med varme dissociation sammenlignet med syredissociations 9.
Inkorporeringen af HFUF som koncentrationen trin tillader større fleksibilitet ved at tilvejebringe evnen til at koncentrere flere organismer. Desuden er det et billigere alternativ til nuværende metode 1623 filtrering muligheder.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Ann Grimm og Michael Zimmerman for kritisk gennemgang af dette manuskript og Doug Hamilton for hans teknisk support.
Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
Timer | VWR | 23609-202 |
Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
Vortex | VWR | 14216-188 |
Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
Cover glass | Corning | 287018 |
EasyStain direct kit | BTF | – |
10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
FITC filter | Nikon | 96302 |
DAPI filter | Nikon | 96301 |
X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
Lens paper | Nikon | 76997 |
Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
Wypall | Kimberly Clark | 34790 |