1. Kromosomberedning Mygglarver har fötts upp med hjälp av ett standardprotokoll som beskrivs i Methods in Anopheles Research finns på webbplatsen för Malaria Forskning och referensreagens Resource Center (MR4) 13. De temperaturer mygga uppfödning ändrades för att ge det högsta antalet kromosomer i imaginal skivor och lägsta dödlighet av larverna. Stegen i mygglarver utveckling fastställdes baserat på storleken på deras huvud kapslar 13. Hatch mygga ägg vid 28 ° C, och efter 2-3 dagar, överföring 2: a eller 3: e instar larver till 16 ° C för Ae. aegypti och Cx. quinquefasciatus och till 22 ° C under en. gambiae. Placera 4: e instar larver på is i flera minuter för immobilisering. Överför larv till en bild med en droppe kall hypoton lösning (0,5% såmedium citrat eller 0,075 M kaliumklorid), och placera den under stereomikroskop. Välj larv med ovala ID (Figur 1B) för ytterligare dissektion. Halshugga larv, och skär nagelbanden från den ventrala sidan av larver bröstkorgen med dissekera sax (Figur 2A). Göra ytterligare sänkning andra eller tredje buken segment att dissekera tarmen från larv. Riktningarna för skårorna visas med pilar. Öppna nagelband och ta bort tarmen och fett kroppen från larv. Ta bort hypoton lösning från bilden med filterpapper, och lägga till en ny droppe hypoton lösning direkt till ID (Figur 2B). Förvara larv i hypoton lösning under 10 min vid RT. Avlägsna hypoton lösning med filterpapper, och applicera Carnoys lösning (etanol / ättiksyra i förhållandet 3:1). När du har lagt fixeringslösning, IDS vända omedelbart vitt och blir väl synliga under mikroskop (Figur 2C </sTrong>). Med hjälp av dissekera nålar, ta bort ID från larv (Figur 2D), och överföra dem till en minskning med 50% propionsyra. Ta bort alla andra vävnader, såsom tarmen och fett kropp, från sliden. Täck ID med unsiliconized 22×22 täckglas, och hålla i 10 minuter vid RT. Täck bilden med filterpapper, och squash vävnaden genom att knacka på radergummit på en penna på omkretsen av täckglas. Kortfattat analysera kvaliteten på bilden med hjälp av faskontrastmikroskop i 100x eller 200x förstoring (Figur 3). Preparat med> 50 kromosom sprider kan anses lämpliga för FISH. Doppa och håll bilden i flytande kväve tills det tar stopp bubblande. Avlägsna täckremsan från sliden med hjälp av ett rakblad, och överföra bilden omedelbart till en container med 70% etanol kyld vid -20 ° C. Lagra vid 4 ° C under minst 1 timme för bästa resultat uttorkning (om nödvändigt, kan diabilder lagras vid thans steg från flera minuter till flera dagar). Dehydratisera objektglasen i en serie av etanol (70%, 80%, 100%) vid 4 ° C under 5 minuter vardera, och lufttorka vid RT. Förvaras torrt bilder vid -20 ° C innan utnyttja dem för FISH. 2. Extraktion av repetitivt DNA Fraktioner Utföra Fisk av BAC-klon DNA-prob på kromosomer från Ae. aegypti och Cx. quinquefasciatus innebär användning omärkta repetitiva DNA fraktioner för att blockera ospecifik hybridisering av DNA upprepas till kromosomerna. Den reassociation av enkelsträngat DNA fragmenteras i bitar av flera hundra bp följer en C 0 t kurva där C 0 är den initiala koncentrationen av enkelsträngat DNA och t är den tid återparning. DNA fraktioner med C0t värden lika med 10 -4 -10 -1 eller 10 ° -10 2 anses som mycket och måttligt repetitiva, respektive. Utdrag 400-500 ng av genomiskt DNA från hela vuxen mygga med Qiagen Blod och Cell Culture Maxikit, och förbereda 100-1000 ng / pl DNA-lösning i 1,2 x SSC. Denaturera DNA genom att placera en säker lås rör med genomiskt DNA i ett värmeblock förvärmts till 120 ° C under 2 minuter. Hög temperatur hjälper till att sträcka DNA i 200-500 bp fragment. Beroende på DNA-koncentrationen, associera DNA genom att placera röret vid 60 ° C under 15-150 minuter för att erhålla C 0 t DNA-fraktioner upp till C 0 t3 (Tabell 1). Placera röret med DNA på is under 2 minuter. Överför DNA till 42 ° C, tillsätt förvärmt 10x S1 nukleas-buffert och S1-nukleas till en slutkoncentration av 100 E per 1 mg DNA, och inkubera under 1 timme. Fällning-DNA genom att tillsätta 0,1 volym av 3 M natriumacetat och 1 volym isopropanol vid RT. Centrifugera vid 14.000 rpm i 20 minuter vid 4 ° C. Tvätta DNA i 70% etanol, och centrifugera igen vid 14.000 rpm under 10 minutervid 4 ° C. Lufttorra och lös DNA pelleten i TE-buffert. Mät DNA-koncentrationen, och visualisera genom gelelektrofores. Vanligtvis den slutliga mängden av repetitiva DNA-fraktioner representerar 35-50% av den ursprungliga DNA beloppet. 3. DNA-sond Märkning Två olika protokoll har använts för märkning BAC-klon DNA-prob och IGS rDNA sond. 3,1 BAC-klon märkning med nick-translation Utdrag BAC-klon DNA från BAC-biblioteket med Qiagen Stor Construct Kit. Bered reaktionsblandningen för nick-translation märkning på is med slutlig volym av 50 ul: 1 pg isolerat BAC-klon-DNA, 0,05 mM vardera av omärkt dATP, dCTP och dGTP och 0,015 mM dTTP, 1 | il av Cy3-dUTP (eller annan fluorokrom), 0,05 mg / ml BSA, 5 pl 10x nick-translationsbuffert, 20 U av DNA-polymeras I, och 0,0012 U DNas. Inkubera vid 15 ° C under 20,5 tim. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 pl 0,5 M EDTA. Förvara sond vid -20 ° C i mörker. 3,2 IGS rDNA märkning med användning av PCR Bered reaktionsblandningen på is med slutlig volym av 50 | il: 200 ng genomiskt DNA, 0,05 mM vardera av omärkt dATP, dCTP och dGTP, 0,015 mM dTTP, 1 | il av Cy3-dUTP (eller annan fluorokrom), 5 pl 10x PCR-buffert, 50 pmol framåt, FN (GTGTGCCCCTTCCTCGATGT) och omvänt, GA (CTGGTTTGGTCGGCACGTTT) primrar för amplifiering försäkringsgarantisystem, och 10 U Taq DNA-polymeras 14. Utför PCR-reaktion med användning av standard-PCR parametrar för försäkringsgarantisystem amplifiering: 95 ° C / 5 min x 1 cykel, (95 ° C / 30 sek, 50 ° C / 30 sek, 72 ° C / 30 sek) x 30 cykler, 72 ° C / 5 min x 1 cykel, och 4 ° C håll 14. Förvara sond vid -20 ° C i mörker. 4. Fluorescent in situ hybridisering <em> denna fisk protokoll omfattar två varianter: den första för att använda BAC-klon DNA som en sond på mitotiska kromosomer Ae. aegypti och Cx. quinquefasciatus och den andra för att använda IGS rDNA på mitotiska kromosomer från An. gambiae. Om du använder BAC klon DNA-sonder, steg hoppa RNas behandling 4,3, 4,4, och samtidig bild / sond denatureringssteg 4,19. Om du använder IGS rDNA sond, förbereda hybridiseringsblandning utan C 0 t-DNA fraktioner, och hoppa separat bild / sond denaturering steg 4,10, 4,11, 4,16 och 4,17. Inkubera objektglasen i 2x SSC under 30 minuter vid 37 ° C. Torka objektglasen i serien av 70%, 80% och 100% etanol i 5 minuter vardera vid RT, och lufttorka. Om du utför fisk med BAC-klon-DNA, fortsätt direkt till steg 4,5. Inkubera kromosom beredning i 0,1 mg / ml RNas lösning under parafilm under 30 min vid 37 ° C. Tvätta två gånger i 2 x SSC under 5 min vardera vid 37 ° C. Sätt bilder iNa burk med 0,01% pepsin och 0,037% HCl-lösning, och inkubera under 5 min vid 37 ° C. Tvätta objektglasen i 1 x PBS under 5 min vid RT. Fix kromosom beredning i en burk med 1% formalin i 1 x PBS framställdes från 10% neutral buffrad formalin under 10 minuter vid RT. Tvätta objektglasen i 1 x PBS under 5 min vid RT. Torka objektglasen i serien av 70%, 80% och 100% etanol i 5 minuter vardera vid RT, och lufttorka förberedelser vid 37 ° C. Om du utför fisk med IGS, gå direkt till steg 4,12 Denaturera bilder i en burk med förvärmd 70% formamid under 2 minuter vid 72 ° C. Dehydratisera objektglasen i serie kall (-20 ° C) 70%, 80%, och 100% etanol under 5 minuter vardera, och lufttorka vid 37 ° C. Förbered hybridiseringsblandning:. 5 pl märkt sond DNA från steg 3, 10 ^ C 0 t-DNA från steg 2 med slutlig koncentration av 0,5 ng / l, och 5 pl 1 ng / l sonikerat laxsperma-DNA för fisk med IGS rDNA, förberedahybridiseringsblandning utan C 0 t DNA-fraktioner. Fällning-DNA genom att tillsätta 0,1 volym av 3 M natriumacetat och 2 volymer etanol. Håll vid -20 ° C under 1-3 timmar. Centrifugera vid 14.000 rpm vid 4 ° C under 20 minuter, avlägsna etanolen, och lufttorka pelleten vid RT. Grundligt lös pelleten i 10 pl hybridiseringsbuffert:. 50% formamid, 20% dextransulfat, 2x SSC Om du utför fisk med IGS, gå direkt till steg 4,18 Denaturera hybridisering blandning under 7 minuter vid 97 ° C, och omedelbart på is under 1 minut. Prehybridize blandningen vid 37 ° C under 30 minuter för att förhindra ospecifik hybridisering av repetitivt DNA till kromosomer. Placera 10 ul av hybridiseringsblandningen på bilden, och täck med en 22×22 täckglas. Förhindra blåsbildning – luftbubblor tas bort med lätt tryck på täckglaset Om du utför fisk med BAC-klon-DNA, fortsätt direkt till steg 4,20 <./ Em> Denaturera prob och kromosom-DNA samtidigt med ett värmeblock vid 75 ° C under 5 minuter. Lim täckglas runt omkretsen med gummi cement. Utför natten hybridisering i en fuktig kammare vid 37 ° C. Ta gummi cement och skyddsremsan från bilden. Tvätta bild 2 min i förvärmd lösning 1 (0,4 x SSC, 0,3% Nonidet-P40) vid 73 ° C. Tvätta objektglasen i lösning 2 (2 x SSC, 0,1% Nonidet-P40) under 5 min vid RT. Motfärga objektglaset med 0,001 mM YOYO-1 i 1 x PBS under 10 min i fuktkammare vid RT. Montera i en liten mängd av reagens Prolong Guld antifad med ett täckglas. Analysera förberedelser under ett fluorescerande mikroskop med lämpliga filter uppsättningar vid 1.000 x förstoring (Figur 4). 5. Representativa resultat Insect ID är placerade i varje segment av larven. Beroende på läget, they förvandlas till olika vävnader i vuxen skede av insekten. De ID, som används för kromosom beredning i detta protokoll, utvecklas till ben i den vuxna skede av mygga. Dessa ID: n finns på den ventrala sidan av larver bröstkorgen och är klart synliga genom ytterhud under mikroskop (figur 1). Vid början 4: e instar larvstadiet, ID har en rund form (figur 1A). Flest mitos, är ~ 175 i ett ID 9 ackumulerade senare "oval" stadium (Figur 1B), vilket måste anses vara den optimala scenen för preparatet. Vid denna tidpunkt delar den mellanliggande ID i två: en förvandlas till ett ben och en annan en förvandlas till en vinge. Vi föredrar att använda de stora ben-ID på "ovala" scenen för kromosom preparatet. Figur 1C visar ID på den senaste fasen av 4: e instar larver utveckling. Vid detta skede,ID: n redan utvecklats till ben och vingar, och innehåller en betydande mängd av differentierade vävnader och ett lågt antal mitos. Detta stadium av ID utveckling bör undvikas för kromosom preparatet. Vi rekommenderar också uppfödning mygglarver vid låga temperaturer:. 16 ° C för Aedes och Culex och 22 ° C för Anopheles Detta bidrar till att öka mängden mitos i ID 9. Figur 2 visar ID-dissektion från bröstkorgen av 4: e instar larv. Eftersom nagelbanden av en levande insekt är svårt att dissekera, rekommenderar vi att du använder dissekera sax istället för nålar som vanligtvis används för larv beredning. Det mest avgörande förfarandet för erhållande av hög kvalitet kromosom preparat är hypoton lösning behandling. För bästa resultat, tar vi bort tarmen och fett kroppen från larver bröstkorgen innan denna behandling. Svullnad av ID-cellerna under detta förfarande bidrar till att sprida kromosoms på en slid (figur 3A). Lämplig kvalitet hos den hypotona lösningen behandlingen kan lätt igen av den runda formen av celler i preparaten (figur 3A, B). Celler med en oval form indikerar otillräcklig hypoton lösning behandling (figur 3C). Väljas för fisk, kromosom förberedelse innehålla minst 50 högkvalitativa kromosom uppslag. Normalt ~ 90% av bilderna framställda med användning av detta protokoll har tillräcklig kvalitet för FISH 9. Vi presenterar två lite olika fiskar protokoll: en avancerad protokoll för FISH med genomisk BAC-klon DNA-prob på mitotiska kromosomer Aedes och Culex och en enkel FISH protokoll för IGS rDNA sond på mitotiska kromosomer Anopheles. Genomen hos Aedes och Culex är mycket repetitiva grund av överrepresentation av överförbara element 7,8. Således utför fisk, som utilizes genomiskt BAC-klon-DNA som en sond, kräver tillsats omärkta repetitiva DNA-fraktioner till proben för att blockera ospecifik hybridisering av DNA upprepas till kromosomer. För utvinning av de repetitiva DNA-fraktioner, är genomiskt DNA denaturerades vid 120 ° C under 2 minuter. Kokande DNA vid en hög temperatur bidrar också till att erhålla DNA i fragment av 200-500 bp. DNA tillåts att associera efter denna behandling. Den mycket repetitiva DNA-fragmenten tenderar att hitta sin partner för återförening snabbare än DNA med unika sekvenser gör. Som ett resultat följer att återförening av DNA en C 0 X t kurva där C 0 är den initiala koncentrationen av enkelsträngat DNA, och t är tiden återparning. DNA fraktioner med C 0 t-värden lika med 10-4 – 10-1 eller 100-102 anses mycket och måttligt repetitiva, respektive. Tiden för återförening för olika C 0 t-DNA fraktioner kan beräknas med ee formel t = C 0 t X × 4,98 / C 0, där t – inkubationstid, C 0 t X – C 0 t fraktion (C0t 1 = 1, C 0 t 2 = 2, osv) och C 0 – initiala DNA-koncentrationen i pg / il 15 (tabell 1). Efter reassociering, den enkelsträngade DNA digererades med S1-nukleas. Vi föredrar att använda alla C 0 t DNA-fraktioner upp till C 0 t 3 tillsammans i stället för den vanliga C 0 t 1 DNA-fraktionen. Dessa C 0 t fraktioner finns några av de måttligt repetitiva DNA-sekvenser och tillsammans normalt innebär 35-50% av den ursprungliga mängden av DNA i Ae. aegypti. Den korrekta proportionen mellan märkt DNA-sond och omärkt C 0 t DNA-fraktion beror på den repetitiva DNA-komponenten i varje särskilt BAC-klon. I genomsnitt använder vi 1:20 prob till C 0 tonDNA-fraktion andel för att få ett godtagbart signaler / bakgrund förhållandet FISH resultatet. Förhybridisering av DNA-proben med C 0 t DNA-fraktioner i ett rör för 30 minuter innan den faktiska hybridiseringen på objektglaset bidrar också till att minska bakgrunden. Märkning, hybridisering själv, och tvätta i detta protokoll utförs med standardförhållanden 12. Fisken Resultaten av två olika märkta BAC klon DNA-prober för mitotiska kromosomer AE. aegypti och Cx. quinquefasciatus visas i figurerna 4A och B, respektive. BAC klon DNA-prober ger starka signaler i en enda position på kromosomerna. Kromosomer visas i figur 1 är motfärgades med YOYO-1 jodid. Detta färgämne ger de bästa bandmönster på Ae. aegypti kromosomerna 9. Alternativt, kan andra fluorescerande färgämnen, såsom DAPI eller propidiumjodid, utnyttjas för the kromosom motfärgning. För att undertrycka fotoblekning av bilderna använder vi förlänga guld antifad monteringsmedium. Denna reagens har god förmåga signal bevarande och även lätt kan avlägsnas från objektglaset genom sköljning i 1 x PBS, om det är nödvändigt att använda samma objektglas för flera hybridiseringar. En enkel version av FISH-protokollet är utformat för hybridisering av IGS rDNA sond på mitotiska kromosomer Anopheles. Ribosomala gener i Anopheles representeras som en polymorf kluster av gener belägna på könskromosomerna 16. En DNA-sond i detta protokoll märks med standard PCR-reaktion genom att lägga fluorescensmärkta Cy3 eller Cy5 dNTP. Eftersom blockering ospecifik hybridisering av repetitiva DNA i eukromatin inte behövs, är alla steg i samband med användning av C 0 t-DNA fraktioner utelämnas. Istället kromosom preparat förbehandlas med RNas för att förhindra hybridisering av IGS rDNA sonden tillde kärnsystemet. Kromosomer och DNA-sonden denatureras samtidigt genom upphettning sliden tillsammans med en prob i en hybridiserings-system vid 75 ° C under 5 minuter. Hybridisering och tvätt i detta protokoll utförs också användning av standardbetingelser för FISH 12. Resultatet av FISH visas i figur 4C: polymorfismen av IGS rDNA hybridisering mellan två X-kromosomer syns tydligt. DNA-koncentrationen ug / ul Återparning tid, min C 0 t 2 0,1 100 0,3 33 0,5 20 0,7 14 0,9 11 1 10 <tdrowspan = "6"> C 0 t 3 0,1 150 0,3 50 0,5 30 0,7 21 0,9 17 1 15 Tabell 1. DNA-koncentration och återparning tider för beredning av C 0 T2 och C 0 t3 fraktioner. Figur 1 Steg för ID-utvecklingen i 4: e instar larv: A) en tidig "rund form" stadium, B) en mellanliggande "oval form" scenen – optimal för Kromosomberedning, C) ett sent skede – olämpligt för kromosom preparat. . Positionerna för ID indikeras med pilar på den ventrala sidan av larver bröstkorgen. Figur 2 Steg av ID dissektion: A) avhuggna larv (riktning nedskärningar anges med pilar), b) larver med dissekerade tarmen i hypoton lösning behandling (ID svälla och bli nästan osynlig), c) larv efter Carnoys lösning ansökan (. ID blir vit och klart synlig), d) dissekeras ID i Carnoys lösning. Positioner för ID i larv anges med asterisker. Figur 3 olika kvaliteter av kromosomen smörfettsprodukter: A) en perfekt kromosom spridning – rund form av cellerna demonstrerar tillräcklig behandling av ID i hypoton lösning, b) en perfekt hypoton behandling – kromosomer är något undersquashed, c) en dålig kromosom spridning. – resultatet avotillräcklig hypoton behandling indikeras av oval form av cellerna. Figur 4. Exempel på fisk med BAC-kloner (A, B) och IGS rDNA (C) i kromosomer Ae. aegypti (A), Cx. quinquefasciatus (B), och An. gambiae (C). 1, 2 och 3 – är antalet kromosomer, X – kvinnligt kön kromosom i en. gambiae.