Ikke-invasiv optisk avbildning av Lymfatisk blodkar av en mus
Summary
Nylig utviklet imaging teknikker som bruker nær-infrarødt fluorescens (NIRF) kan bidra til å klargjøre hvilken rolle lymfesystemet spiller i kreft metastasering, immunrespons, sår reparasjon og andre lymphatic-assosierte sykdommer.
Abstract
Lymphatic karsystemet er en viktig del av sirkulasjonssystemet som opprettholder væske homeostase, gir immun overvåking, og formidler fettopptaket i tarmen. Men til tross for sin kritiske funksjon, er det forholdsvis liten forståelse av hvordan lymfesystemet tilpasser seg betjene disse funksjonene i helse og sykdom 1. Nylig har vi vist evne til å dynamisk bilde lymphatic arkitektur og lymfe "pumpe" handling i normale mennesker, så vel som hos personer som lider lymphatic dysfunksjon bruker Trace administrasjon av en nær-infrarødt lysrør (NIRF) fargestoff og en tilpasset, Gen III- intensivert imaging system 2-4. NIRF bildebehandling viste dramatiske endringer i lymfatisk arkitektur og funksjon med sykdom hos mennesker. Det er fortsatt uklart hvordan disse endringene skjer og nye dyremodeller blir utviklet for å belyse deres genetiske og molekylære basis. I denne protokollen, presenterer vi NIRF lymphatic, small dyr bildebehandling 5,6 med indocyanine grønn (ICG), et fargestoff som har vært brukt i 50 år hos mennesker 7, og en NIRF dye-merket syklisk albuminbinding domene (cABD-IRDye800) peptid som fortrinnsvis binder mus og menneskelig albumin 8 . Ca 5,5 ganger sterkere enn ICG har cABD-IRDye800 en lignende lymfatisk klaring profil og kan injiseres i mindre doser enn ICG å oppnå tilstrekkelige NIRF signaler for imaging 8. Fordi begge cABD-IRDye800 og ICG binder seg til albumin i interstitialrommet 8, kan de begge skildre aktivt protein transport inn i og innenfor lymfekar. Intradermal (ID) injeksjoner (5-50 pl) av ICG (645 uM) eller cABD-IRDye800 (200 uM) i saltløsning blir administrert til dorsal aspekt av hver bakpote og / eller til venstre og høyre side av bunnen av halen på et isofluran-bedøvet mus. Den resulterende fargestoff-konsentrasjonen i dyret er 83-1,250 ug / kg for ICG eller 113-1,700 ug / kg forcABD-IRDye800. Umiddelbart etter injeksjoner, er funksjonell lymphatic bildebehandling utført for opptil 1 time ved hjelp av en tilpasset, små dyr NIRF imaging system. Hel dyr romlig oppløsning kan skildre fluorescerende lymfekar på 100 mikron eller mindre, og bilder av strukturer inntil 3 cm i dybden kan erverves 9. Bildene er kjøpt ved hjelp av V + + programvare og analysert ved hjelp av ImageJ eller MATLAB programvare. Under analysen, er påfølgende regioner av interesse (ROIs) omfatter hele kardiameteren trukket langs en gitt lymfe fartøy. Dimensjonene for hver ROI holdes konstant for en gitt fartøy og NIRF intensitet måles for hver ROI til kvantitativt vurdere "pakker" av lymfe beveger gjennom fartøy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi bruker en tilpasset, små dyr NIRF imaging system for å ta bilder av merket lymfeårer i mus. Å konstruere filmer av lymph bevegelse, 300 eller flere bilder samles. For funksjonell analyse av lymfekar fra filmer, er to eller flere ROIs manuelt trukket langs en lymph fartøy. Dimensjonene på ROIs holdes konstant for hvert fartøy, og er omtrent diameteren av fartøyet. Mens hele dyret romlig oppløsning kan skildre fluorescerende lymfekar på 100 mikron eller mindre, kan en macrolens for finere oppløsning benyttes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til Eva Sevick: NIH R01 CA128919 og NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
