Summary
שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.
Abstract
מערכת כלי דם הלימפה היא מרכיב חשוב של מערכת הדם ששומר על איזון נוזלים, מספקת מעקב חיסוני, ומתווך ספיגת שומן במעיים. ואולם, למרות הפונקציה הקריטית שלו, יש הבנה מועטת יחסית מאיך מערכת הלימפה מסתגלת לשרת פונקציות אלה במחלה ובריאות 1. לאחרונה, יש לנו הפגנתי יכולת ארכיטקטורה דינמית תמונת הלימפה והלימפה פעולה "שאיבה" בבני אדם רגילים, כמו גם באנשים הסובלים תפקוד הלימפה באמצעות ממשל זכר לצבע קרוב אינפרא האדום ניאון (NIRF) ומותאם אישית, Gen-III התעצם מערכת הדמיה 2-4. NIRF ההדמיה הראתה שינויים דרמטיים בארכיטקטורת הלימפה ולתפקד עם מחלה אנושית. עדיין לא ברור כיצד השינויים הללו מתרחשים ומודלים של בעלי חיים חדשים מפותחים כדי להבהיר בסיס הגנטי ומולקולרי שלהם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הלימפה NIRF, שלקניון חית הדמית 5,6 באמצעות indocyanine ירוק (ICG), צבע ששמש במשך 50 שנים בבני אדם 7, ותחום NIRF צבע הכותרת מחזורי אלבומין מחייב (CABD-IRDye800) פפטיד שנקשר מעדיפים עכבר ו8 אלבומין אנושיים . כ 5.5 פעמים בהירות יותר ICG, CABD-IRDye800 יש פרופיל אישור הלימפה דומה וניתן להזריק במינונים נמוכים יותר מאשר ICG להשיג אותות NIRF מספיקים להדמיה 8. מכיוון שגם לאגד CABD IRDye800-ICG ולאלבומין במרחב הבין 8, שניהם יכולים לתאר תחבורת חלבונים פעילה אל ובתוך lymphatics. Intradermal (ID) זריקות (μl 5-50) של ICG (645 מיקרומטר) או CABD-IRDye800 (200 מיקרומטר) בסליין מנוהלות להיבט הגבי של כל רגלו האחורית ו / או בצד ימין והשמאל של הבסיס זנב של עכבר isoflurane-מורדם. ריכוז צבע וכתוצאה מכך הוא בעלי החיים 83-1,250 מיקרוגרם / ק"ג לICG או 113-1,700 מיקרוגרם / ק"ג עבורCABD-IRDye800. מייד לאחר זריקות, הדמיה תפקודית הלימפה מתבצעת לתקופה של עד 1 שעה באמצעות מערכת מותאמת אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה. רזולוציה מרחבית חיים שלמה יכולה לתאר את כלי ניאון הלימפה של 100 מיקרון או פחות, ותמונות של מבנים ל3 סנטימטרי עומק ניתן לרכוש 9. תמונות נרכשה באמצעות V + + תוכנה ונותחה באמצעות ImageJ או תוכנת MATLAB. במהלך ניתוח, אזורים רצופים של ריבית (Rois) המקיפה את קוטר הכלי כולו נמשכים לאורך כלי הלימפה נתונה. הממדים עבור כל ROI נשמרים קבוע לכלי נתון ועוצמת NIRF נמדד עבור כל ROI כמותית להעריך "מנות" של הלימפה עוברת דרך כלי דם.
Protocol
כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים של אוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז (יוסטון, טקסס), מחלקה לרפואה ההשוואתית, ומרכז להדמיה מולקולרית לאחר בדיקה ואישור של הפרוטוקול על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי שלהם והשתמשו ועדה (IACUC) או צער בעלי חי ועדה (AWC).
1. הכנת בעלי החיים 24 שעות לפני ההדמיה
צריכים לעשות את הצעדים הבאים (במידת צורך) היום לפני הדמית הלימפה מתקיימת.
- מקום חיות בתיבת אינדוקציה ורגועה עם isoflurane.
- ברגע שבעלי החיים הם במצב של הרדמה עמוקה (מעקב עם תמרון בוהן קמצוץ), מקום חיה מורדמת על משטח חיתול / קצפת ואף עמדה בחרטום חובר לגז isoflurane.
- קליפ כל השיער / הפרווה (אם בכלל) באזור להיות צלם.
- החל סוכן הסרת שיער (Nair) לאזור המקוטע ולהשאיר אותו on העור לתקופה של עד 3 דקות.
- לנגב בעדינות את כל סוכן הסרת השיער עם גזה חמה ולחה או מגבת נייר.
- לשטוף בעדינות את העור במים חמים ולייבש בעדינות את האזור עם גזה או מגבת נייר.
- אפשר חיות להתאושש על כרית חימום או תחת מנורת חום, ולחזור לכלוב שלהם.
2. היום של הדמיה
- סוכן הדמיה לשחזר עם מים סטריליים, אז לדלל שימוש סטרילי, רגיל (0.85%) מלח כדי להשיג 645 מיקרומטר (5 μg/10 μl) לICG או 200 מיקרומטר (6.8 μg/10 μl) לCABD-IRDye800. שמור פתרונות בחושך תנאים ושימוש עד 6 שעות של כינון מחדש.
- מקום חיות בתיבת אינדוקציה ורגועה עם isoflurane.
- ברגע שבעלי החיים הם במצב של הרדמה עמוקה (מעקב עם תמרון בוהן קמצוץ), מקום חיה מורדמת על צידו על משטח חיתול / קצפת ואף עמדה בחרטום חובר לגז isoflurane.
- לכבות את האורות (כך שהחדר הואכהה). במידת צורך, אור הלוגן שולחן קטן יכול לשמש לכמות קטנה של אור כדי לראות זריקות.
- שימוש במזרק אינסולין עם מחט 31-מד, להזריק 5 μl מזהים עד 50 μl של ICG או CABD-IRDye800 בהיבט הגבי של כל רגלו האחורית ו / או בצד השמאל וימין של בסיס הזנב, בהתאם האזור של עניין (ראה דיון). כל חומר מוזרק עשוי לנוע 0.083-1.25 מ"ג / ק"ג (ICG) או 0.113-1.7 מ"ג / ק"ג (CABD-IRDye800). כרכי הזרקה ישתנו בזן בעלי חיים והזרקה. לעכברי athymic, נפח ההזרקה יכול להיות 5 (את רגלו אחורית) או 10 μl μl (בסיס הזנב). אם בעל חיים הם לא תחת מערכת ההדמיה להזרקה (הים), הצב את החיה תחת מערכת ההדמיה מייד לאחר הזרקה (הים).
- אם אין ספיגה לצבוע הוא ראה בlymphatics, צעד 2.5 יהיה צורך לחזור במידת צורך לפרוטוקול חיה.
- ברגע lymphatics נראה, לכסות את אתר ההזרקה בסרט בידוד שחור או רשות שחורהל.
- לרכוש תמונות הלימפה של עד 1 שעה באמצעות V + + תוכנה וחיה קטנה, מערכת הדמית NIRF. (בעלי חיים הורדמו עם isoflurane ונשימה מנוטרות בעוד שתמונות רוכשות.) בעוד שחיה קטנה, imagers NIRF זמין מסחרי, אנו מנצלים מערכת מותאמת אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה המורכבת של דיודת ליזר 785 ננומטר (1005-9mm-78503 , אינטנסיבי, הצפון ברונסוויק, ניו ג'רזי) לבושה עם עדשה אספריים (C24TME-B, Thorlabs, ניוטון, NJ), מפזר (ED1-C20, Thorlabs), והמסנן (LD01-785/10-25, Semrock, רוצ'סטר, ניו יורק ) כדי ליצור שדה עירור אחיד המאיר את החיים בקצב fluence אירוע של פחות מ 1.4 mW לסנטימטר מרובע 10. אלקטרון הכפלת מכשיר טעון יחד-(EMCCD, PhotonMax512, פרינסטון מכשירים, טרנטון, ניו ג'רזי) מערכת מצלמה עם שני מסננים 830 ננומטר (AND11333, אנדובר קורפ, סאלם, ניו המפשייר) ועדשת Nikkor 28-מ"מ (1992, ניקון, מלוויל, ניו יורק) משמש ללכידת תמונות הלימפה עם שילוב times של 200 אלפיות שני להדמיה דינמית ו800 אלפית שניות להדמיה סטטית 5. ראה איור 1 לתצורת מערכת, לשולחן לפרטים נוספים של כל רכיב, ודיון לדיון קצר של מאפייני imager מפתח.
- אפשר חיות להתאושש על כרית חימום או תחת מנורת חום ולחזור לכלוב שלהם, או להרדים.
- נתח את התמונות באמצעות ImageJ או תוכנת MATLAB. ראה איור 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה להדמית הלימפה NIRF בעכברים
כאשר ICG או CABD-IRDye800 מוזרק מזהה בבסיס הזנב של עכבר רגיל, מערכת כלי דם הלימפה בין אתר ההזרקה בבסיס הזנב והבלוטות לימפה מפשעתי (LN) צריכה להיות מייד דמיינה. זמן קצר לאחר הזרקה (כמה שניות עד דקות), כלי הלימפה בין LN מפשעתי וLN בית השחי יש דמיין כפי שניתן לראות באיור 2. מאז lymphatics בעכברים משתנה מחיה לחיה כפי שהם עושים בבני אדם, שונה באדריכלות בין חיות ניתן לראות כפי שמוצג באיור 3. כאשר ICG או NIRF-CABD מוזרק מזהה בהיבט הגבי של רגלו האחורית של עכבר רגיל, שני כלי הלימפה ניתן דמיינו ניקוז לLN popliteal כפי שמוצגים באיור 4. בחלק מהמקרים, קשה להבחין בשני הכולים בשל קרבתם הקרובה אחד עם השני.
> אמצעי זהירות להדמית הלימפה NIRF השפיע
בפעמים, ויזואליזציה של lymphatics מתעכבת, ברוב המקרים בשל ההזרקה תת עורית להיות מנוהלת (SC), במקום תעודת זהות. כאשר זריקות SC מקבלות, תחבורת הלימפה לא יכולה להיות דמיינו באופן מיידי כפי שניתן לראות באיור 5 (א) בגלל הזמן הנוסף הנדרש לצבע כדי להגיע ולהיות נלקח על ידי נימי הלימפה בעור. זוהי הסיבה מדוע חשוב להזריק מזהה במקום SC. בהזדמנות, כלי הלימפה חריג הם נצפו, כפי שניתן לראות באיור 5 (ב), באזור פצע כגון נשיכה או חתך מקוצץ השיער / פרווה. טמפרטורת הגוף של בעל החיים צריכה להישמר בתוך טווח נורמלי, כמו שינוי טמפרטורת גוף עלולה לגרום לתפקוד הלימפה לא עקבי. מגבלות של הטכניקה כוללות התקדרות של כלי הלימפה ניאון בפיגמנטציה של עור, חוסר היכולת לדימוי הצינורות הלימפה בית החזה העמוקים עקבלאור פיזור ברקמות, ואת ההשפעה הידועה של הרדמה על תפקוד הלימפה.
באופן כללי, זה לוקח דיפו ID של ICG או CABD-IRDye800 עד 2 ימים כדי לנקות את הכבד והכיס, ועד 3 ימים כדי לנקות את אזור ההזרקה. כאשר אות ניאון שייר תתבהר, פרוטוקול ההדמיה ניתן לחזור, ומאפשר הדמית הלימפה אורכים כדי להעריך את השינויים בארכיטקטורה או פונקצית הלימפה לאחר התערבות כלשהי.
ניתוח של פונקצית הלימפה
את התמונות שנרכשו ניתן לטעון לImageJ או MATLAB לניתוח נתונים. באזור קבוע, Rois המעגלי מסומן או "נמשך" לכל האורך של כלי הלימפה הניאון כפי שנעשה עבור הדמית הלימפה אנושית 10 ובעלי חיים 5 כפי שמוצג באיורי 6 (א) ואיור 6 (ד). Rois נבחר כך שהקוטר שלהם הוא כ הקוטר של התמונה של לזרוחכלי NT. עוצמת הקרינה הממוצעת בתוך כל ROI זממה כפונקציה של זמן הדמיה כדי להעריך את המהירות הנעה ותדר של "מנות" של הלימפה לצבוע עמוסה מונעת לאורך כלי הלימפה כפי שמוצג באיורי 6 (ב) ואיור 6 (ה ). כדי להעריך את מהירות הלימפה ההתפשטות והתדירות של הנעת הלימפה, שניים ROI של, עם וריאציות בעצמת ניאון מינימום מייצגות את ההתפשטות של מנות של הלימפה הוא מקסימום או מוגדר וברור, נבחרים ופרופילי עצמת הניאון שלהם הם זממו כפי שמוצגים באיורים 6 (ג) ו 6 (ו). מהירות ההתפשטות מחושבת על ידי לקיחת היחס של המרחק בין 2 ROI זמן המעבר של ולחפיסת הלימפה כדי להפיץ ביניהם. על ידי בחינת מספר פעימות ניאון או "מנות" מגיעות להחזר השקעה אחת לזמן, תדירות כויץ מחושבת. בעוד טכניקה זו מספקת שיטה היחידה לAsseתדירות ומהירות של נעת הלימפה הנעת ss "מנה", אחרים העריכו בעקיפין תחבורת הלימפה על ידי מדידת פינוי המחסן של סוכן הדמיה ולכן חישוב קבועי שיעור הסרת 11. בגרורות סרטניות 10 וזיהום מוקדם, אנו מוצאים אובדן הנעת הלימפה בבעלי חיים. אחרים מדווחים שינויים בהתכווצות בתגובה ל12 דלקת פרקים. בבני אדם, אנו מדווחים הנעה מוגברת לאחר טיפולים כוללים ניקוז בצקת לימפתית פנאומטי דחיסה 13 וניקוז לימפטי ידני (עיסוי) 14.
איור 1. מערכת הדמית NIRF הוא מותאם אישית שנבנה עבור הדמית הלימפה חיה קטנה. המכשיר מורכב מדיודת ליזר 785 ננומטר לבוש עם עדשה אספריים, diffusאה, ומסננים כדי ליצור שדה עירור אחיד המאיר את החיים ומצלמת EMCCD, עדשה מתמקדת, ומסננים אופטיים כדי ללכוד תמונות של הלימפה ניאון 10.
איור 2. כאשר 10 μl של ICG או CABD-IRDye800 מוזרק מזהה בבסיס הזנב של עכבר רגיל באמצעות מחט 31-מד, מערכת כלי דם הלימפה בין אתר ההזרקה בבסיס הזנב וLN הלימפה מפשעתי צריך להיות מייד דמיינו. תמונות פלואורסצנציה דינמיות רכשו מייד לאחר הזרקה ועד להזרקה הבאה דקות 20. זמן קצר לאחר הזרקה (כמה שניות עד דקות), כלי הלימפה בין אתר ההזרקה וLN מפשעתי, ולאחר מכן לאזור בית השחי הוא LN דמיין על התצוגה לרוחב. התמונה מוצגת באיור 2 נלקחה 5 דקות. לאחר ההזרקה wi10 μl ה ICG של תעודת זהות בבסיס הזנב. נקודת האור בין האזורים מפשעתי ובית השחי היא כבדה.
איור 3. מאז lymphatics בעכברים משתנה מחיה לחיה כפי שהם עושים בבני אדם, שונה באדריכלות בין חיות ניתן לראות ויציב לאורך זמן. עכבר # 124 הוזרק עם ICG בבסיס הזנב ומייד צלם ביום 1. הפנל העליון מכיל את התמונה שהתקבלה ביום 1 וכן תמונה המתקבלת כעבור 2 ימים (ביום 3) באמצעות אותו העכבר וזריקה / פרוטוקול הדמיה. הפנל התחתון מכיל תמונות המתקבלות מעכבר אחר (# 127) מוזרק עם ICG ו1 יום צלם באופן מיידי, ולאחר מכן צלם ביום 3. בעוד אדריכלות הלימפה (הדפוס של כלי הלימפה) משתנית בין מולהשתמש # 124 ו# 127, את התמונות המתקבלות באמצעות NIRF הנן עקביות לכל עכבר בימים 1 ו 3.
איור 4. כאשר μl 5-10 של ICG או NIRF-CABD מוזרק מזהה בהיבט הגבי של רגלו האחורית של עכבר רגיל, שני כלי הלימפה יש מדמיין ניקוז לLN popliteal. תמונות פלואורסצנציה דינמיות רכשו מייד לאחר הזרקה ועד להזרקה הבאה דקות 20. במקרים מסוימים זה קשה להבחין שני הכולים בשל קרבתם כפי שמודגם בתמונה המוגדלת מיוצגת על ידי התיבה המקווקות. לעכבר הנציג המוצג כאן, 10 μl של ICG הוזרק בהיבט הגבי של הכף השמאלית, האחורית (אתר הזריקה הראשון) ובצד השמאלי של בסיס הזנב (אתר הזרקה שני). תמונה זו הייתה captured כ 2 - 3 דקות לאחר הזריקה הראשונה וכ 30 שניות - 1 דקות לאחר ההזרקה השנייה.
איור 5. (א) לעתים יזואליזציה של lymphatics מתעכבת או לקוי, ברוב המקרים בשל הזריקה להיות מנוהלת SC במקום תעודת זהות. כאשר 10 μl של ICG או CABD-IRDye800 מוזרק SC בבסיס הזנב של עכבר רגיל באמצעות מחט 31-מד, תחבורת הלימפה לא תהיה מייד דמיינו בגלל הזמן הנוסף הנדרש לצבע כדי להגיע ולקחת על ידי נימי הלימפה בעור. כמו כן, בשל זריקת SC העמוקה יחסית, ייתכן שאין ספיגת הלימפה ולכן אין להדמיה של כלי הדם והבלוטות לימפה. באיור 5 ( ), עכבר הוזרק עם 10 μl של ICG בבסיס הזנב SC והתמונות נרכשו 5 דקות לאחר הזרקה. הצבע באזור ההזרקה יכול להיות חזותי ואין כלי הלימפה או בלוטות לימפה יכול להיות חזותי. זו הסיבה זריקות זהות הן חשובות. (ב) ויזואליזציה מהצד הגחוני של החיה של כלי הלימפה חריגים הנובעים מפצע נתקלה יום אחד מוקדם יותר במהלך הסרת פרווה עם קוצץ (אתר פגיעה ברקמות ציין בצד ימין של בעל חיים). התמונה נתפסה כ 5 דקות אחרי 10 μl של ICG היה מנוהל מזהה בבסיס הזנב בכל הצד ימני והשמאלי. בצד הלא הפגוע (חיה של שמאל), LN מפשעתי יכול להיות חזותי, כמו גם כלי הלימפה efferent ישר יחסית ניקוז מעלה לכיוון LNS בית השחי. בצד ימין של העכבר, לעומת זאת, מערכת כלי דם הלימפה נורמלית נקטעה עקב פציעה ונראית חריג בשל תיקון רקמות (מגלידות).
לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 6. ניתוח כמותי של תפקוד כויץ הלימפה מורכבת מבחירת Rois לאורך כלי הלימפה ניקוז מ() LN מפשעתי ולבית השחי LN (ד) באתר ההזרקה בהיבט הגבי של הכף לLN popliteal. תמונה מוגדלת (הבלעה ב()) של המלבן האדום המקווקו מדגימה את הבחירה של Rois לאורך ספינת הניאון. אוסף של עוצמת קרינה ממוצעת כפונקציה של זמן לכל Rois מ( א) ו (ד) מיוצג על ידי העלילה פסאודו הצבע מוצגת ב( ב) ו (ה), בהתאמה. ההפרעות בעוצמת קרינה על פני פיקסלים מייצגות הלימפה "דופק" ומתפשט דרך Rois וar דואר במקביל לחצים. עוצמת הקרינה הממוצעת לRois 22 עד 45 אחת מ( ב) מוצגת ב( ג) ועוצמת הקרינה הממוצעת לRois אחת 18 ו 34 מ (ה) מוצגות ב( ו). פרופילי עוצמת קרינה כפונקציה של זמן (כפי שמוצג ב( ג) (ו)) להקל על זיהוי של חבילות של הפצת הלימפה והמיצוי של זמן המעבר והמרחק בין 2 Rois. 2 Rois נבחר מבוסס בחלקו על המיקום שלהם לאורך כלי הלימפה ואת הבהירות שבה ריבוי הלימפה המייצג מינימום המקסימום ומוצגים. מהירות מחושבת כיחס בין המרחק בין 2 Rois וזמן המעבר שנלקח בין עוצמת קרינת שיא. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה
er.within עמודים = "תמיד"> 
איור 7. כדי להמחיש את lymphatics ניקוז מהאזור מפשעתי לאזור בית השחי, להזריק בצד השמאלי או ימני של בסיס הזנב. באופן כללי, כדי להמחיש את צד השמאל, להזריק במיקום 5, 6, 9, או 10, וכדי להמחיש את צד ימין, להזריק במיקום 7, 8, 11, או 12. מקומות 1 עד 4 עשויים להיות נחותים מדי על הזנב לספיגה אופטימלית לדמיין ניקוז לימפטי מהאזור מפשעתי לאזור בית השחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו משתמשים במערכה אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה כדי ללכוד תמונות של כלי הלימפה שכותרתו בעכברים. לבנות סרטים של תנועת הלימפה, 300 או יותר תמונות שנאספו. לניתוח פונקציונלי של lymphatics מסרטים, שתיים או יותר Rois מצויר ידני יחד כלי הלימפה. מידותיו של Rois נשמרות קבועה לכל כלי והן כ הקוטר של כלי השיט. בעוד כל רזולוציה מרחבית בעלי חיים יכול לתאר כלי הלימפה ניאון של 100 מיקרון או פחות, macrolens לתמונות ברזולוציה עדינה יכולה להיות מועסק 10. תמונות אור הלבן להתייחסות אנטומית גם ניתן לרכוש באמצעות מנורת צריכת חשמל נמוך. יש לציין שאם סוכני הדמיה מורכבים מצבעי ניאון אחרים עם עירור שונה / ספקטרום פליטת קרינה, אז את המסננים שתוארו לעיל יש לשנות כדי לשמור על ביצועי הדמיה, ומינון סוכן עשוי נדרש התאמה גם כן. כמו כן, אם אורך גל העירור הוא less מ 750 ננומטר, אז autofluorescence עלול לגרום, אות רקע תגדל, ורגישות הדמיה תקטן. בנוסף, חוסר יציבות של סוכנים בפתרון עשוי למנוע את השימוש בכמה צבעים NIRF, כגון 7 Cyanine (Cy7).
בחירה של אתר ההזרקה המתאים תהיה תלויה בכלי הלימפה שהם נחקרים. כדי להמחיש את lymphatics ניקוז מהאזור מפשעתי לאזור בית השחי, תצטרך להזריק בצד השמאלי או ימני של בסיס הזנב, כפי שמוצג באיור 7. כדי להמחיש את lymphatics ניקוז מהאזור המפואר, תצטרך להזריק היבט הגבי של רגלו האחורית. זה חיוני כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה בתוך טווח נורמלי, כמו שינוי טמפרטורת גוף עלולה לגרום לתפקוד הלימפה לא עקבי. בנוסף, בשל הטווח הדינמי המוגבל של רוב ccds, אתרי ההזרקה צריכים להיות מכוסים בנייר שחור כדי לחסום thereb אור ניאוןy המאפשר הדמיה של דימר ניקוז כלי הלימפה. הדמיה צריכה להתבצע בחדר חשוך כדי להפחית את אותות רקע לא רצויים עקב פליטה של אור בלהקת פלואורסצנטי מאת האורות בחדר. בעלי החיים חייבים להיות גם שוכבים על רקע שחור תוך הדמיה מבוצעת כדי להפחית backscatter האור.
הדמית הלימפה NIRF עשויה לאפשר הבנה טובה יותר של מחלות הלימפה וכיצד שינויי ארכיטקטורה והתפקוד הלימפה ביחס למחלה או פציעה. לדוגמה, צוות המחקר השתמש בNIRF הדמיה בחיות קטנות כדי לספק phenotyping הלימפה של בעלי חיים 6,15 ולזהות שינויים בתפקוד הלימפה ואדריכלות עם גרורות סרטניות 10. בבני אדם, בטכניקה נעשתה שימוש כדי לזהות סימנים מוקדמים של בצקת לימפתית 2, להעריך תגובה לטיפול 13,14,16 בצקת לימפתית, ובני משפחת פנוטיפ עם הפרעות תורשתיות הלימפה. עם זאת, לא פולשנית visualization של lymphatics העמוק (> 3 סנטימטרים) בבני אדם הוא מוגבל על ידי הפיזור של אור ברקמות. תמונות של מבני הלימפה עד 3 סנטימטרי עומק נרכשו ב 9 חזירים והדמיה אנושית. בבני אדם, lymphoscintigraphy MRI והדינמית שנוצלה כדי לכמת את זמן המעבר של חומר ניגוד מאתר ההזרקה לבלוטות הלימפה במחלה. עם זאת, חסר להם רזולוציה של זמן ומרחב מספיק כדי להמחיש את האירועים הנעה הלימפה צפו בי קלות עם NIRF. בנוסף, lymphatics הבריא הם לא דמיין עם עקב MRI כדי חוסר החדות. NIRF הדמיה לא פולשנית, בניגוד confocal, מיקרוסקופיה multiphoton, והדמית intravital. בדרך כלל שיטות מיקרוסקופיה confocal וmultiphoton לנצל רקמה חלקית או לחלוטין resected. שיטות Scintographic להצריך שימוש באטומים רדיואקטיביים וcannulation כלי לפעמים קטין. שיטה נוספת כדי להמחיש את lymphatics כרוך הדמית intravital שבמהלכו הוא העכברהמתת החסד והדרמיס נמשך בחזרה לאחר הזרקת ID של אוונס הכחול צבע. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת הדמיה תפקודית או קווי אורך 17,18. גרורות LN יכולות להיות צלמו באמצעות סימנס Inveon PET / CT, עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת הדמיה של מבנה הלימפה או פונקציה 19.
בעוד שהכותבים לא ממליצים ולא מאשרים כל מכשיר הדמיה מסחרית מסוים, הניסיון שלנו מצביע על כך שהבחירה של מקור אור ומסננים אופטיים עשויה להיות גורם החשוב ביותר הקובע את הרגישות של המכשיר. כפי שתואר על ידי ג 'ואח'., להדמיה מוצלחת של ריכוזים נמוכים של צבע, חייב להיות חפיפה מינימאלית בין ספקטרום הפליטה של מקור אור וספקטרום השידור של המסננים האופטיים 20. שיקול מרכזי נוסף הוא ספקטרום הבליעה ופליטה של NIRF הצבע משמש. בICG זה נייר וCABD-IRDye800 יש spe דומהCtra וכך תאר את אורך גל ליזר דיודה ושילובי מסנן יכולים לשמש לכל אחד, עם זאת, אם צבע אחר הוא לשמש שלא יספוג ו / או לזרוח באורכי גל אלה, אורך הגל של מקור האור ואת המסננים האופטיים צריך להיות בהתאם. ICG יכול להיות מספיק עבור יישומים רבים, וכבר ה-FDA. NIRF-CABD לא ה-FDA לשימוש בבני אדם, אבל עשוי להיות שימושי עבור הדמית חיה. ICG אין קישור כימי שאריות לחיבור moieties מיקוד, סוכנים אחרים כך ניאון, כגון NIRF-CABD, נמצאים בפיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
סופרים אין לי מה לחשוף, אבל כמה מחברים רשומים בפטנט.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים לאוות Sevick: NIH R01 CA128919 וNIH R01 HL092923.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture's instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
