Ikke-invasiv optisk billeddannelse af lymfatisk vaskulatur på en mus
Summary
Nyligt udviklede billeddannelsesteknikker hjælp nær-infrarøde fluorescens (NIRF) kan til at belyse den rolle, det lymfatiske system spiller i cancermetastase, immunrespons, sårreparation og andre lymfatiske-associerede sygdomme.
Abstract
Det lymfatiske kar-systemet er en vigtig del af kredsløbet, som opretholder fluid homeostasis, giver immunovervågning, og medierer fedtabsorption i tarmen. Men på trods af sin kritiske funktion, er der forholdsvis ringe forståelse af, hvordan lymfesystemet tilpasser sig betjene disse funktioner i sundhed og sygdom 1. For nylig har vi demonstreret evne til dynamisk billede lymfatisk arkitektur og lymfe "pumpe" handling hos normale forsøgspersoner samt i personer, der lider lymfatisk dysfunktion ved hjælp af spor administration af en nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) farvestof og en brugerdefineret, Gen III- intensiveret billeddannelsessystem 2-4. NIRF imaging viste dramatiske ændringer i lymfe arkitektur og funktion med sygdom hos mennesker. Det er fortsat uklart, hvordan disse ændringer sker og nye dyremodeller bliver udviklet for at belyse deres genetiske og molekylære grundlag. I denne protokol, præsenterer vi NIRF lymfatisk, small dyr billeddannelse 5,6 ved hjælp af indocyaningrøn (ICG), et farvestof, der har været anvendt i 50 år hos mennesker 7 og en NIRF farvestof-mærkede cykliske albumin bindingsdomæne (cABD-IRDye800) peptid, der fortrinsvis binder muse-og humant albumin 8 . Omkring 5,5 gange lysere end ICG, cABD-IRDye800 har en lignende lymfatisk clearance profil og kan injiceres i mindre doser end ICG at opnå tilstrækkelige NIRF signaler til billeddannelse 8. Fordi begge cABD-IRDye800 og ICG binder til albumin i det interstitielle rum 8, kan de begge viser aktivt protein transport til og inden lymfevejene. Intradermal (ID) injektion (5-50 pl) af ICG (645 uM) eller cABD-IRDye800 (200 uM) i saltvand indgives til det dorsale aspekt på hver bagpote, og / eller den venstre og højre side af bunden af hale af en isofluran-bedøvede mus. Den resulterende farvestofkoncentration i dyret er 83-1,250 ug / kg til ICG eller 113-1,700 ug / kg tilcABD-IRDye800. Umiddelbart efter injektioner, er funktionel lymfatisk billeddannelse udført i op til 1 time under anvendelse af en tilpasset, lille dyr NIRF imaging system. Hele dyr rumlig opløsning kan afbilde fluorescerende lymfekar på 100 mikrometer eller derunder, og billeder af konstruktioner på op til 3 cm i dybden kan erhverves 9. Billeder er erhvervet ved hjælp af V + + software og analyseres ved hjælp ImageJ eller MATLAB software. Under analyse bliver efterfølgende områder af interesse (ROI'er) omfatter hele fartøj diameter trukket langs en given lymfeknuder fartøj. Dimensionerne for hver ROI holdes konstant for et bestemt fartøj og NIRF intensitet måles for hver ROI til kvantitative vurderinger "pakker" af lymfeknuder bevæger sig gennem fartøjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi bruger en brugerdefineret, lille dyr NIRF imaging system til at tage billeder af mærkede lymfekar i mus. For at konstruere film af lymfeknuder bevægelse, er 300 eller flere billeder indsamles. For funktionel analyse af lymfekarrene fra film, er to eller flere ROI'er manuelt trukket langs en lymfeknuder fartøj. Dimensionerne af ROIs holdes konstant for hvert fartøj, og er omtrent diameteren af karret. Mens hele dyr rumlig opløsning kan afbilde fluorescerende lymfekar på 100 mikrometer eller derunder, k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud til Eva Sevick: NIH R01 CA128919 og NIH R01 HL092923.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
