כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור
במאמר זה
סיכום
תקציר
דרך ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי שעתוק, Oct4, Klf4, Sox2 וcMyc, תאים אנושיים סומטיים ניתן להמיר למדינת pluripotent, יצירת תאים שנקראים מושרים pluripotent גזע (iPSCs) 1-4. iPSCs מטופל ספציפי חסר הדאגות המוסריות האופפות תאי גזע עובריים (ESCs) ויעקפו דחייה חיסונית אפשרית. לפיכך, iPSCs שמשך תשומת לב רבה ללימודי מחל דוגמנות, ההקרנה של תרכובות תרופתיות, טיפולי משובים 5.
הראנו הדור של iPSCs האדם transgene חינם מחולים עם מחלות ריאה שונות באמצעות קלטת אחת excisable polycistronic lentiviral תאי גזע (STEMCCA) קידוד יאמאנאקה גורמי 6. קווי iPSC אלה נוצרו מfibroblasts עור, סוג התא הנפוץ ביותר המשמש לתכנות מחדש. בדרך כלל, קבלת fibroblasts דורשת עור ביופסיה ואחרי ההתרחבות של התאזה בתרבות לכמה קטעים. חשוב מכך, מספר הקבוצות דיווח תכנות מחדש של תאי דם היקפי אדם לiPSCs 7-9. במחקר אחד, גרסה מושרה ט של וקטור STEMCCA הועסקה 9, שנדרשת תאי הדם להידבק בו זמנית עם lentivirus constitutively פעיל קידוד טטרציקלין transactivator ההפוך. בניגוד לפיברובלסטים, תאי דם היקפיים ניתן לאסוף באמצעות נהלים פולשנית, צמצום אי הנוחות ומצוקתו של החולה באופן משמעותי. פרוטוקול פשוט ויעיל לתכנות מחדש של תאי דם באמצעות וקטור excisable אחת מכונן עשוי להאיץ את היישום של טכנולוגית iPSC על ידי שהופך אותו נגיש לקהילת מחקר רחבה יותר. יתר על כן, תכנות מחדש של תאי דם היקפיים מאפשר לדור של iPSCs מאנשים שביש להימנע מהם ביופסיות עור (כלומר. חריג הצטלקות) או עקב תנאי מחלה קיים preventiגישת ננוגרם לביופסיות אגרוף.
כאן אנו מדגימים פרוטוקול עבור הדור של iPSCs אדם מתאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות וקטור lentiviral floxed-excisable אחת constitutively להביע 4 הגורמים. PBMCs נאסף טרי או מופשר הם התרחבו במשך 9 ימים כפי שתוארו 10,11 בחומצה אסקורבית המכילה בינונית, SCF, IGF-1, IL-3 ו-EPO לפני שtransduced עם lentivirus STEMCCA. תאים אז מצופים על MEFs ומושבות ESC דמויים יכולות להיות דמיינו שבועות לאחר הדבקה. לבסוף, שיבוטים נבחרו הורחבו ונבדקו לביטוי של סמני pluripotency SSEA-4, טרה-1-60 וטרה-1-81. פרוטוקול זה הוא פשוט, הגיוני ועקבי ביותר, ומספק מתודולוגיה אמינה לדור של iPSCs אדם מ4 מ"ל נגיש של דם.
פרוטוקול
1. בידוד והרחבת תאי mononuclear דם היקפיים (PBMCs)
יום 0
- צייר 4 מ"ל של דם היקפי לתוך צינור BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן. הפכו צינור 8-10 פעמים וסרכזת ב1800 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. באופן אידיאלי, בשלב זה צריך להיעשות תוך 2 שעות של אוסף.
- איסוף תאי mononuclear (MCS) על ידי pipetting המעייל באפים (שכבת תאים בין הקריש חוסם ופלזמה) לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה. הבא נפח כולל עד 10 מ"ל עם תמיסת מל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנחנו מדגימים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם מPBMCs באמצעות וקטור lentiviral אחת. איור 1 א מציג ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. הדם נאסף לתוך צינור BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן, ולאחר צנטריפוגה, תאי mononuclear ניתן לאסוף מהממשק בין ג'ל פוליאסטר והפלזמה (אפי מעייל) (1B איור). את PBMCs הבודד לאחר מכן הרחיב בתרבות במשך 9 ימים. איור 2 משווה PBMCs ביום: 0 ויום 9, מראה כי התאים מתחלקים באופן ניכר. כ 10-15 ימים שלא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנחנו להלן מתארים את השימוש של וקטור lentiviral STEMCCA לייצר iPSCs אדם מתאי mononuclear בודד מכמה מיליליטרים של דם היקפי נאסף טרי. פרוטוקול יכול לשמש גם לתכנת מחדש PBMCs הקפוא (מתקבל ישירות מהמעייל באפים), פירוט של השלכות מעשיות משמעותיות כאשר ניצול תאי תורם נרכשו ממיקום מרוחק. לפני הגיוס של תכנות מחדש, PBMCs המבודד חייבת לעבור שלב התרחבות קריטית שהופך את אוכלוסייה מתרבה בריאה של תאים המתאימים יותר לתכנות מחדש גרעיני. זו נצפתה בקלות על ידי הנוכחות של 'אשכול ענבים כמו "הא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
מחקרים אלו מומנו בחלקו פרס NIH UO1HL107443-01 לGJM ו-GM על ידי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב | חברה | מספר קטלוגים | תגובות (אופציונלי) |
| Tube BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 בינוני תאי גזע | איכות ביולוגית | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | אטלנטה ביולוגית | S10250 | |
| החלפת נוק סרום | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | נמלי pm-2 | |
| עט / דלקת | Invitrogen | 15140 | |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030 | |
| חומצות אמינו לא חיוניות | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Biomedicals MP | 190242 | |
| חומצה אסקורבית | סיגמא | A4544 | |
| IGF-1 | מו"פ מערכות | 291-G1 | |
| IL-3 | מו"פ מערכות | 203-IL | |
| SCF | מו"פ מערכות | 255-SC | |
| EPO | מו"פ מערכות | 286-EP | |
| דקסאמתאזון | סיגמא | D4902 | |
| Polybrene | סיגמא | H-9268 | |
| bFGF | מו"פ מערכות | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| קיט לדוגמא מרקר תאי גזע עוברי | Millipore | SCR002 |
מקורות
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of huma....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
