Бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) для исследований; Получение достаточном количестве отобранных образцов Выход

Summary

Мы описываем технику исследований для волоконно-оптического бронхоскопии и бронхоальвеолярного лаважа с использованием низкое давление всасывания. Метод используется для сбора иммунных клеток из легких бронхоальвеолярного поверхностей. Местный анестетик и мягкий седации (мидазолам) используется. Субъекты терпеть процедура также и опыт минимальные побочные эффекты.

Abstract

Мы описываем технику исследований для волоконно-оптического бронхоскопии с бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), используя ручной рука, проводимая всасывания для удаления прилипших клеток и легких подкладка жидкость с поверхности слизистой оболочки. В исследовательской среде, БАЛ позволяет выборки врожденных (легких макрофагов), сотовые (В-и Т-клетки), и гуморальный (иммуноглобулина) ответы в легких.

БАЛ является международно признанным в исследовательских целях, а с 1999 техника была выполнена в> 1000 субъектов в Великобритании и Малави нашей группой.

Наша методика использует нежный ручной всасывание привил жидкости; этот предназначена для максимального объема БАЛ вернулся и применять минимальную силу сдвига на мерцательного эпителия в целях сохранения структуры и функции клеток в БАЛ и сохранить жизнеспособность способствовать росту клеток в Экс Vivo культуры. Методика исследования поэтому использует большие модули громкостиtillate (обычно порядка 200 мл) и использует ручной всасывание, чтобы уменьшить повреждение клеток.

Пациентам предоставляется местный анестетик, предложил седации (мидазолам), и терпеть процедуру хорошо с минимальными побочными эффектами. Устные и письменные подлежит информация улучшает толерантность к и письменное информированное согласие является обязательным. Безопасность субъекта имеет первостепенное значение. Субъекты тщательно отобраны с помощью четких критериям включения и исключения.

Этот протокол включает в себя описание потенциальных рисков и меры, принятые для их устранения, список противопоказаний, пред-и пост-процедур проверки, а также точные бронхоскопии и лабораторные методы.

Introduction

Фон

Волоконно-оптический бронхоскопия была разработана для клинической практики, она широко используется как диагностически и терапевтически ^1,2. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) удаляет прилипших клеток и легких подкладка жидкость с поверхности слизистой оболочки; биопсия используется, чтобы пробовать слизистых и подслизистых тканей. В исследовательской среде, БАЛ позволяет выборки из врожденной (легких макрофаги ^3-5), сотовый (B-и Т-клетки ⁶⁾ и гуморальный (иммуноглобулин ⁷⁾ ответы в легких.

БАЛ является международно признанным в научных целях ⁸ и с 1999 года техника была выполнена в> 1000 субъектов в Великобритании и Малави нашей группой. Мы используем эту технику в исследованиях врожденных, клеточном и гуморальных иммунных ответов на пневмококковой антигена в том числе экспериментальных человека пневмококковой перевозки ^9,17, биомассы дыма ^5, ВИЧ и вакцинации, и адъюнкт-сту леченияумирает в выздоровления от пневмонии. Наша методика использует нежный ручной всасывание привил жидкости; этот предназначена для максимального объема BAL вернулись и применять минимальную силу сдвига на мерцательного эпителия в целях сохранения структуры и функции клеток в БАЛ.

В контексте исследования БАЛ использует другую технику из, что практикуется респираторных и интенсивной врачей по уходу (часто называют бронхиальная стирки, моечных, лаважа или БАЛ), которые стремятся получить диагностическую или терапевтическую пользу. Методика исследования предназначены для сбора клеток и сохранить жизнеспособность, чтобы облегчить рост клеток в Экс Vivo культуры. По этим причинам метод исследования использует больший объем instillate (как правило, порядка 200 мл) и использует ручной всасывания, чтобы уменьшить повреждение клеток. Пациентам предоставляется местный анестетик, предложил седации (мидазолам), и терпеть процедуру хорошо с минимальными побочными эффектами. Устные и письменные субъективнот информация улучшает толерантность к письменное информированное согласие является обязательным ^1.

Цель

Общая цель в том, что процедура должна быть безопасна и эффективна. Субъекты не должны испытывать никаких физиологическое нарушение и операторы должны постоянно собирать более 100 мл БАЛ от субъектов. После процедуры, предметы должны испытывать минимальные побочные эффекты.

Безопасность

Безопасность субъекта имеет первостепенное значение. Субъекты тщательно отобраны с помощью четких критериям включения и исключения. Этот протокол включает в себя описание потенциальных рисков и мерах, принятых для их устранения.

Противопоказания к исследовательской бронхоскопии может быть выражено как абсолютное или относительное, и включаются в нашей протоколе исследования, как исключения и включения критериев. Наши сюжеты, все на экране, чтобы обеспечить полное здоровье.

Абсолютные противопоказаниявключают нестабильную шейного отдела позвоночника, зависания гипоксии, нестабильная стенокардия, геморрагический диатез, и злокачественную сердечной аритмии.

Относительные противопоказания, в том числе тех условиях, связанных с повышенным частоты осложнений, включают в себя:

Общие сведения: плохо кооператив подлежит ^1, любое значительное целом медицинская проблема например, эпилепсия, предыдущая плохо переносится бронхоскопия, известный побочные реакции на лидокаин или мидазолам, беременность, плохое питание.

Органов дыхания: гипоксия [насыщенности (SATS) в эфире <94%], гиперкапнии, нестабильной астмой ^1, значительно нарушенной дыхательной функции ¹ (ОФВ ₁ <1 л), легочная гипертензия.

Сердечно-сосудистые: уремии, в течение 6 недель инфаркта миокарда ^1, верхней полой вены обструкции.

Другое: иммуносупрессии (наша группа регулярно выполняет эту процеДюре в ВИЧ-положительных субъектов).

См. Таблицу 1 – риски, связанные с БАЛ для исследования.

Protocol

1. Объекты встречены по прибытию дыхательной исследовательского Медсестра Предметом было поститься> 4 ч для твердой пищи и 2 ч для прозрачных жидкостей 1. Процедура проводится как однодневная случае с соответствующими проверками до и после-процедур (как в стандартной политики больницы). Предметом носит больничную одежду. Небольшой датчик канюля вводится (в идеале в левой руке) и остается на месте до конца после процедуры восстановительного периода 1. Preprocedure наблюдения взяты (артериальное давление, частота сердечных сокращений, кислородные насыщенности [SATS]). Предметом передается бронхоскопии люкс. 2. Тема готовится к процедуре в люксе на Респиратор исследовательского Клиницист опыт в Бронхоскопия Оборудование для мониторинга прилагается в том числе, 3-канальной ЭКГ, пульсоксиметр 1,10 и сфигмоманометре. Anesthetподдержка микросхемы не требуется в том числе письменного информированного согласия. Кислород может быть доставлен по носовые канюли со скоростью до 4 л / мин, для достижения САЦ> 90% 1. Оператор проверяет бронхоскоп, это включает в себя обеспечение эффективного всасывания путем аспирации стерильный физиологический раствор. Местная анестезия с лидокаином достигается в носовые проходы (используя Instillagel 1) и слизистой оболочки полости рта (при использовании Xylocaine) Если седативный уместно и по просьбе субъекта, внутривенное мидазолам вводят 1. Соответствующий разворот агент (флумазенила) сразу же доступны. Реанимационное оборудование должны быть легко доступны 1,10. 3. Бронхоскоп вставлена ​​и позиционируется Интубации, как правило, через нос. Если это не представляется возможным в связи с носовые полипы, воспаленные раковин, или какого-либо дискомфорта, то субъект интубированных через рот (рот-охранник используется для предотвращенияповреждению рамки или зубов субъекта). Местная анестезия в гортани выполняется с использованием 4% лидокаина, как правило, в общей сложности 4-6 мл используется. Обычно это вызывает кашель на закапывания. Голосовые связки передаются, и дальнейшие слизистой анестезии с использованием 2 мл аликвоты 2% лидокаина в килем, на разделение правой нижней доле (RLL) и правой средней доли (RML) и при входе RML. Бронхоскоп расположен внутри ОПМ, в идеале в медиальном сегменте, в положении, когда она является достаточно, чтобы быть в безопасном положении дистального, но не слишком, так что дистальный дыхательных путей разрушается, когда прилагается усилие всасывания ('Интерес тест "с помощью кнопки всасывания ). Удобное положение указано в ходе испытания подмигнуть по бронхоскоп, которые могут быть в полной мере поддерживается в положении на bronchoscopist и дыхательных путей, что не в полной мере близко сразу на деликатного всасывания. 4. БАЛ выполняется Четыре 60 мл шприцы предварительнонаполненный подогретой физиологического раствора – 60 мл, 50 мл, 50 мл и 40 мл в последовательных шприцев. Когда объект и bronchoscopist готовы первый шприц физиологического раствора закапывают по бронхоскопии помощником в то время как bronchoscopist сохраняет позиции в RML. Нежный всасывания рука Затем выполняется с помощником, используя тот же порт и 50 мл шприц. Эта процедура повторяется еще 3 раза, с максимальным объемом 200 мл, используемых в нашем конкретном техники. Извлеченный БАЛ выталкивается мягко в маркированные контейнеры уже состоявшихся таяния льда. Стеклянная тара может быть presiliconized для того, чтобы ингибировать прикрепление клеток и максимальную отдачу клеток. БАЛ появляется туманное против света с поверхностными мыльных пузырей, образованных поверхностно. Бронхоскоп медленно полностью выведены. Транспортируется БАЛ без ожидания на льду в течение немедленной обработки. 5. Тема восстановления </p> Предметом восстанавливается в течение 2-4 часов на дыхательной исследовательской медсестры на отделении. За это время они имеют право на отдых, а затем только есть и пить> 60 мин 1 после процедуры (когда их ласточка оценивается как сейф), для того, снизить риск аспирации. Сообщение процедурные наблюдения контролироваться и регистрироваться. Клиническое обследование происходит перед сбросом. Субъект проинформировал перед выпиской о распространенных побочных эффектов (лихорадка, умеренная право субмаммарной дискомфорт в груди, боль в горле) и с учетом контактный номер в случае, если существенные побочные эффекты возникают 1. Предметом следуют вверх на 1-5 дней после процедуры с клиническим контакта. Это может быть либо по телефону или лично. 6. Клетки Изолированные в лаборатории – Выполнить на тающем льду, где только возможно Объем БАЛ записывается и фильтровали через двойной слой стерильной марлевой тампонаудалить слизь пробки в prechilled, стерильные 50 мл центрифужные пробирки. Клетки осаждали центрифугированием при 500 х г при 4 ° С в течение 5-10 мин и промывают при интенсивном перемешивании в 50 мл холодного нормального физиологического раствора. Центрифугирование повторяли один раз. Клетки ресуспендируют в культуральной среде (RPMI-1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки + 2 мМ L-глутамина, пенициллин + [40 МЕ / мл], стрептомицин [75 МЕ / мл] и амфотерицин В [0,5 МЕ / мл]) и дифференциального подсчета выполняется с помощью равного объема трипанового синего и гемоцитометра. Суспензию клеток нормализуется до требуемой плотности (мы используем 1 × 10 6 клеток / мл), введенных с помощью пипетки в соответствующие ткани культуральных планшетах и инкубируют при 37 ° С в течение 3 часов, чтобы позволить макрофагов присоединению. 1 мл этой клеточной суспензии на лунку подходит для культуральных планшетах с 24 лунками. Для работы лимфоцитов, после 3 ч инкубации культуральную среду осторожно пипеткой вверх и вниз 3x, и собирали. Эта среда содержит лимфоцитыи неадгезивные макрофаги и могут быть использованы для оценки функции лимфоцитов, он также может быть использован в стадий очистки, например, с CD14 магнитных шариков, чтобы удалить макрофаги. Для работы макрофагов, после 3 ч инкубации среду тщательно удалены с минимальным пипетки и заменена свежей, теплой среде без антибиотиков (RPMI 1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки + 2 мМ L-глутамина). Макрофаги являются приверженцем планшета для культуры ткани (см. рисунок 1).

Representative Results

Хорошие клинические результаты объем БАЛ более 100 мл и предмет, который пережил в крайнем случае, незначительный дискомфорт (см. Таблицу 1). Это требует спокойную и сотрудничества тему. Врач должен быть уверен, полностью готовы (материалы), и понимание к добровольца. Интер-и внутри-предмет изменчивость в клеточной выходом (в том числе дифференциальных пунктам) был описан. Дифференциальные количества клеток от здоровых субъектов, как правило,> 90% макрофагов с небольшим числом нейтрофилов (<2%) и лимфоциты (5-10%). БАЛ клетки центрифугировали на предметных стеклах могут быть окрашены с дифференциальным ядерной пятно для получения этой информации (рис. 1). На рисунке 1, БАЛ клетки были зафиксированы и окрашены с использованием окрашивания Hemacolor в соответствии с инструкциями изготовителя. По крайней мере, 300 клеток должны учитываться для получения надежных результатов для макрофагов,нейтрофилы и лимфоциты; 500 клеток на редких типов клеток. Опасность Риск Снижение в этом протоколе по: Влияние бронхоскопии и БАЛ 1, 14 Легкий дискомфорт <25% 14 # Соответствующее обезболивания и седации. Уверенный и заботливый подход к теме. Носовое кровотечение <1% # Мягкий давление только носовой интубации. Если предметом дискомфорт или сузились диафрагмы – устные интубация вместо этого. Эндобронхиальная кровоизлияния (кровохарканье) <0,1% * 15 Нет биопсии приняты. Тщательный контроль при бронхоскопии – избегая слизистой дыхательных путей. Nausеа, рвота и аспирационная пневмония <0,02% 14 # Пост для твердой пищи> 4 ч preprocedure 1. Адекватная местная анестезия. В положении полулежа положение во время процедуры. Тщательное после процедуры наблюдения. Лихорадка 0.01 14 – 1% #, 16 Относится к воспалению, и может свести к минимуму путем максимального сбора БАЛ. Только Одноместный доля БАЛ. # Боль в нос / горло и охриплость <25% 14 # Адекватные местной анестезией из носа, горла и гортань (минимизации кашель). Инфекция <0,1% в ВИЧ отрицательным, 1% в ВИЧ-инфицированных 14 # Стандартная процедура бронхоскоп стиральная 1. Только Одноместный доля БАЛ. # Ранняя диагностика инфекции: клиническое обследование в течение 1 ч апг клиническая контакт 1-5 дней после бронхоскопии. Боль в груди / кашель <0,2% 14 # Одноместный доля только БАЛ. Максимальный БАЛ коллекция. # Влияние наркотиков: лидокаин, мидазолам Аритмия Очень редкий * Максимум 5 мг / кг 14 лидокаин используется. Утепленные физиологический раствор закапывают. # Пульсоксиметрия (Сац> 90% с кислородной), кардиоконтроля всей процедуры. Бензодиазепинов антагонист (флумазенила) немедленно доступны. Дезориентация / агитация <0,1% † # Кардио дыхания Очень редкий * * Не испытали в нашей группе в более чем 1500 исследовательских процедур. † Idiosyncratic а не реакции зависит от дозы. # Опыт нашей группы в более чем 1500 исследовательских процедур. Таблица 1. Риски, связанные с БАЛ для исследования. Это включает в себя опасность или риск, и как это уменьшается с помощью описанной методики. Последствия бронхоскопии / БАЛ а также последствий любых лекарственных препаратов, применяемых включены. Рисунок 1. Предметное стекло микроскопа Показаны BAL макрофаги и случайные нейтрофилов. БАЛ клетки были зафиксированы в метаноле и окрашивали Hemacolor красный (эозин Y) и голубой (лазурь B).

Discussion

Для того чтобы достичь хороших результатов в следующем полезны:

1. Хорошо anesthetisation на базе языка и задней ротоглотки. Это важно, потому что это улучшает процедурный толерантность субъекта и общий комфорт.
2. Либо педиатрический (наружный диаметр 3,4-3,6 мм) или взрослого бронхоскоп (наружный диаметр 4.8-5.9 мм) могут быть использованы.
3. Если есть дискомфорт во время носового интубации, предпочтительно пероральное интубации. В общем носовой интубация либо просто техника или следует отказаться.
4. После первоначального закапывания лидокаина в ротоглотки, субъект может предпочесть бронхоскоп, чтобы быть отозвано до начала анестезии, особенно если бронхоскоп вставляется в устной форме.
5. Убедитесь, по крайней мере, 10 х 10 мл шприцы предварительно заполнен только 2-4 мл лидокаина. Воздух должен быть оставлен в шприцах, позволяющих усовершенствовать доставку анестезии непосредственно на шнуры и эндобронхиальной слизистосб.
6. Поскольку кашель во время процедуры значительно снижает урожай BAL; используя подогретый физиологический раствор и имеющие хорошие слизистой анестезии важны для уменьшения этого.
7. В 50 мл шприцы должны быть предварительно заполненные с подогреваемой физиологического раствора. Она является общей для первых 50 мл физиологического раствора привили с получением между 10-20 мл из-за потери мертвого пространства, а остальные, впадающей в терминальных дыхательных путей. Дополнительные аликвоты вернуть большую долю жидкости.
8. Оператор должен всегда проверять бронхоскоп до интубации, включая обеспечение эффективного всасывания путем аспирации стерильный физиологический раствор. Потеря всасывания может обычно происходят из-за перегибов трубы или утечки вокруг связей с бронхоскоп или всасывающего устройства.
9. Во время ручной всасывания, в идеале дыхательных путей не должны разрушаться. Если всасывающий периодически разрушается дыхательных путей, BAL возвращается сводятся к клапанного механизма, и местное воспаление и кровотечение, скорее всего: это в свою очередь делает м дыхательных путейруды раздражительным и кашель более вероятно. Выбор наиболее подходящей subsegmental филиал RML и применение низких давлений всасывания Поэтому обе важны.
10. Когда воздух постоянно атмосферный перепроверить подключение шприца к бронхоскоп и также положение бронхоскоп в дистальной дыхательных путей. Если это повторяющаяся проблема, после процедуры убедитесь, что нет никаких отверстий в самой бронхоскоп.
11. BAL от курильщиков часто темнее в связи с наличием внутриклеточных частиц. Курильщики могут терпеть бронхоскопию менее хорошо, и есть увеличение кашель.
12. Предпочтительный БАЛ выход объем> 100 мл. Выход> 150 мл превосходно. Мы не испытывали никаких урожаев> 170 мл. Там нет линейной зависимости между доходностью клеток и БАЛ выходом громкости.
13. Доходность <100 мл являются, по нашему опыту, скорее всего, привести к побочным эффектам, таким как кашель, боль в груди и лихорадка. Мы советуем, что субъекты с выходами <100 мл быть выздоровеетВеред в положении на левом боку, то это может помочь дренаж любого оставшегося легочной жидкости.
14. Клиническая следует связаться с предметом в течение 1-5 дней, чтобы убедиться никаких побочных эффектов.
15. Мидазолам седации используется для <50% субъектов в Великобритании и <5% в Малави. Мидазолам не представляется непосредственно улучшить переносимость; некоторые операторы считают, что седативный эффект иногда может быть контрпродуктивным в поддержании согласованной (и обнадеживающим) диалог с предметом.
16. По нашему опыту, существует значительная обучение с этой техникой. Например координация между врачом и медсестрой занимает много времени и дает зачастую ниже в начале процесса обучения.
17. У ВИЧ-положительных больных, мы используем антибиотики профилактически prebronchoscopy.

Materials

Material	Company	Catalogue Number	Comments
Fibreoptic bronchoscope, light and suction source	unspecified
Surgical gown, sterile gloves	unspecified
Sphygnomanometer	unspecified		For continuous patient monitoring
Pulse oximeter	unspecified		For continuous patient monitoring
3 lead ECG monitor	unspecified		For continuous patient monitoring
Nasal oxygen delivery 2-4l/min	unspecified
Lidocaine 10% spray (Xylocaine)	AstraZeneca		For topical anaesthesia
Lidocaine hydrochloride 2%	unspecified		For topical anaesthesia
Lidocaine gel (Instillagel)	Farco-Pharma, Germany		Alternative products available from other suppliers
Normal saline, sterile 200ml	unspecified		Warm to 30oC
10ml taper-end syringe (x10)	unspecified		For administration of lidocaine
Intravenous cannula 18G	unspecified		For administration of midazolam
Midazolam	unspecified		For sedation
Flumazenil	unspecified		Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
60ml taper-end syringes (x4)	unspecified		For normal saline injection and BAL fluid withdrawal. May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
Sterile gauze swab	Vernaid, UK		Alternative products available from other suppliers
Sterile container for BAL fluid	See text and comments		Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
Sigmacote	Sigma, UK	SL2	Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer’s MSDS
Centrifuge	unspecified		At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
Shandon Cytospin centrifuge	Thermo Scientific, UK		For differential count only
RPMI 1640 medium with L-glutamine	Sigma, UK	R8758	Alternative products available from other suppliers
Fetal bovine serum	Sigma, UK	F6178	Alternative products available from other suppliers
Penicillin-Streptomycin	Sigma, UK	P4333	Alternative products available from other suppliers
Amphotericin B	Sigma, UK	A2942	Alternative products available from other suppliers
Tissue culture plates	Greiner Bio-One, UK	662160	Alternative products available from other suppliers
Glass microscope slides	unspecified		For differential count only
Shandon cytofunnel	Thermo Scientific, UK	A78710003	For differential count only
Shandon cytoclip	Thermo Scientific, UK	59910052	For differential count only
Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)	Merck, Germany	111661	Use according to manufacturer’s instructions