Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione passo-passo le procedure necessarie per eseguire le misurazioni della meccanica del sistema respiratorio, nonché la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi usando la tecnica delle oscillazioni forzate (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).
La tecnica delle oscillazioni forzate (FOT) è un potente strumento, integrativo e traslazionale permettere la valutazione sperimentale della funzione polmonare nei topi in modo completo, dettagliato, preciso e riproducibile. Esso fornisce misurazioni della meccanica del sistema respiratorio attraverso l'analisi dei segnali di pressione e di volume acquisite in reazione ad predefinito, piccola ampiezza, forme d'onda oscillatoria flusso d'aria, che sono tipicamente applicati in apertura delle vie aeree del soggetto. Il presente protocollo dettagli i passaggi necessari per eseguire in modo adeguato le misure oscillazioni forzate nel topo, utilizzando un ventilatore a pistone controllato dal computer (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada). La descrizione è suddivisa in quattro parti: fasi preparatorie, la ventilazione meccanica, misure di funzione polmonare e l'analisi dei dati. Esso comprende anche informazioni su come valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata in topi anestetizzati, una comune applicazione di questo technique che si estende anche ad altri esiti e le varie patologie polmonari. Le misurazioni ottenute in topi naive come pure da un modello guidato stress ossidativo di danno delle vie aeree vengono presentati per illustrare come questo strumento possa contribuire ad una migliore caratterizzazione e la comprensione dei cambiamenti fisiologici studiati o modelli di malattie nonché per applicazioni in nuove aree di ricerca.
Caratterizzazione adeguata delle proprietà meccaniche dei polmoni nei piccoli animali è diventato essenziale in quanto la rapida crescita di modelli murini nella scienza respiratoria. Quando è eseguita utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate (FOT), una tecnica utilizzata anche in soggetti umani, queste misurazioni forniscono un approccio potente, integrativo e traslazionale per studiare i cambiamenti fisiologici significativi. UFT misurazioni sono tipicamente ottenuti analizzando i segnali di pressione e di volume acquisite in reazione ad un predefinito, piccola ampiezza, forma d'onda oscillatoria flusso d'aria (indicato anche come perturbazione o segnale di ingresso) applicata in apertura delle vie aeree del soggetto 1. Nella sua forma più semplice, una perturbazione UFT sarebbe una singola forma d'onda sinusoidale ad una frequenza ben definita. Perturbazioni più complessi consistono tipicamente di una sovrapposizione di una selezione di specifica (primi fra) le forme d'onda di frequenza che copre un ampio spettro. La decomposizione del multifrequenzasegnali di ingresso e uscita nei loro componenti utilizzando la trasformata di Fourier permette il calcolo della impedenza di ingresso del sistema respiratorio (ZRS), cioè la funzione di trasferimento tra l'ingresso e di uscita, ad ogni frequenza compresa nel perturbazione 2. Pertanto, UFT consente la valutazione simultanea meccanica respiratoria su una gamma di frequenze in una sola manovra 2. Montaggio modelli matematici avanzati (ad esempio il modello di fase costante 3) ai dati di impedenza quindi permettono una suddivisione della risposta nelle vie aeree (centrale e periferico) e parametri dipendenti del tessuto del parenchima polmonare 1, 3. Poiché molti fattori che influenzano la risposta fisiologica (ad esempio frequenza respiratoria, volume corrente, volume polmonare, delle vie aeree superiori, gli sforzi respiratori spontanei, i tempi delle misurazioni) sono controllati e standardizzati dal sistema di misurazione e procedure sperimentali, 1 la tecnica è tappoin grado di generare misurazioni precise e riproducibili a condizione che sia eseguita correttamente. L'obiettivo di questo articolo è di fornire una dettagliata descrizione cronologica della procedura necessario per eseguire tali misurazioni nei topi. Il protocollo si compone di quattro parti: fasi preparatorie (reagenti, attrezzature e soggetti), la ventilazione meccanica, misure di funzione polmonare e l'analisi dei dati. Esempi di risultati rappresentativi della meccanica del sistema respiratorio generati utilizzando un ventilatore a pistone controllato dal computer (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada) sono forniti. Questi sono stati ottenuti da topi naive nonché da un modello guidato stress ossidativo di danno delle vie aeree caratterizzata da infiammazione delle vie aeree, i danni delle cellule epiteliali e una maggiore reattività delle vie aeree alla metacolina inalata per aerosol 4. Anche se questo protocollo è spesso usato per valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata, si estende ad altri esiti e various patologie comprese asma, malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD), enfisema, fibrosi polmonare, danno polmonare nonché di modelli di topi transgenici di patologie simili alla malattia umana. I risultati della ricerca che utilizzano questo strumento può contribuire ad una migliore caratterizzazione e la comprensione dei cambiamenti fisiologici o modelli di malattia e per l'espansione in nuove aree di ricerca.
Il continuo studio di disfunzione delle vie respiratorie come si riferisce ad asma e altri disturbi polmonari rimane fondamentale per la comprensione dei meccanismi alla base della malattia e lo sviluppo di opzioni di trattamento. L'uso del mouse per malattia delle vie aeree modello è stato essenziale nel guadagnare la comprensione in questi meccanismi di malattia. Quando si considera la valutazione disfunzione delle vie aeree in un oggetto piccolo come un topo, avere strumenti affidabili e precisi con cui misurare la funzione polmonare è un fattore critico. Inoltre, avere strumenti in grado di fornire approfondimenti sulla posizione di rotta erettile o l'effetto terapeutico è inestimabile. La tecnica UFT combina tutti questi attributi e fornisce un approccio potente, integrativo e traslazionale per valutare le variazioni fisiologiche.
Per avere successo con questo tipo di misura nei topi, particolare attenzione deve essere data a pochi passi, e cioè la calibrazione del sistema, la resistenza del endotracheale cannula, il tipo di nebulizzatore (così come le impostazioni di funzionamento) il posizionamento dell'animale e la standardizzazione della storia volume polmonare. Inoltre, è indispensabile per ottenere insiemi di dati validi che il sistema respiratorio del soggetto rimane passivo durante le misurazioni. Ciò può essere ottenuto mediante la somministrazione di un agente paralizzante muscolare, lavorando ad un piano profondo di anestesia o iperventilazione soggetto per indurre apnea (vedi Tabella 1). Gli investigatori possono iniziare padroneggiare il sistema e il suo software operativo, se lo si desidera, con carichi di prova, durante l'acquisizione delle competenze necessarie per le misure nei topi. Sarebbe quindi logico per generare risultati riproducibili in animali naïve prima di muoversi verso modelli di malattia o topi trattati. Dal momento che una percentuale importante di modelli di malattia nella ricerca delle vie respiratorie comporta esponendo gli animali ad agenti quali allergeni, tossine, sostanze inquinanti, fumo di sigaretta o gas, la variabilità nei risultati ottenuti con i measurement tecnica descritta in questo articolo potrebbe quindi essere influenzato dalla procedura esposizione utilizzato. Standardizzazione dei processi sperimentali chiave (ad esempio utilizzando l'esposizione controllato da computer e sistemi di misura 6, 13, 14) potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo nel ridurre la variabilità.
Gli esempi presentati in questo articolo rappresentano una selezione dei risultati tipici della naïve e cloro-topi esposti esperimenti, evidenziando i punti di forza e le limitazioni della tecnica. Come visibile ad esempio in figura 6, la tecnica è in grado di generare le misure di funzione polmonare riproducibili. Mentre sono stati segnalati analoghi valori di resistenza al basale tra i ceppi di topi, le differenze di elastanza sono stati tuttavia osservati 15. Modifiche sostanziali sono inoltre da attendersi tra neonato e topi adulti 16. Come per gli altri nella valutazione fisiologica vivo, risultati di alta precisione, come esimoose generato dal UFT, sono dotati di una concessione per lo stato naturale dei soggetti. Questo principio, che viene indicato come il principio di indeterminazione fenotipizzazione 1, si applica al presente protocollo, nel senso che le misure devono essere fatte in anestetizzato, tracheotomizzato (o per via orale intubato) e ventilato meccanicamente soggetti. Un'altra limitazione della tecnica è osservabile in Figura 5D-5F in cui i dati non sono disponibili le concentrazioni più elevate per il gruppo cloro esposta perché l'adattamento del modello di fase costante ai dati è povera di sopra dei livelli moderati di broncocostrizione. Tuttavia, gli animali gravemente bronchoconstricted potrebbero essere valutati analizzando ZRS direttamente 15, oppure utilizzando software di terze parti post analisi per adattarsi modelli matematici più complessi, per esempio tenendo conto della eterogeneità di funzione meccanica 17. Dataset esclusi possono osservare anche se le vie aeree dell'animale non sono sufficientemente passive o se la resistenza della cannula è troppo alta. Come regola generale, la resistenza della cannula non deve superare la resistenza dell'animale al basale. Lavorare con una cannula di più grande diametro interno e / o più breve lunghezza contribuirà a ridurre la resistenza cannula. Infine, l'attuale dimostrazione di misurazioni UFT in mouse può essere percepita come una metodologia di tempo e quindi meno efficienti o meno applicabili a studi longitudinali rispetto alle tecniche meno invasive. Tuttavia questi ultimi sono associati a una grande incertezza sulla base dei loro risultati e sono visti da molti come imperfetto 1. Misurazioni invasive ripetute sono possibili negli animali per via orale intubati, anche se tecnicamente più impegnativo 17.
Dagli esempi forniti, i risultati hanno dimostrato l'equivalenza delle due generazioni del sistema flexiVent a produrre misurazioni della meccanica respiratoria, nonché vie respiratorie hyperreactività e ipersensibilità alla metacolina inalata dopo cloro-esposizione nei topi. Quando usato per caratterizzare o capire cambiamenti fisiologici o modelli di malattia, l'aspetto misura dettagliata collegati con la tecnica può contribuire ad estendere lo stato attuale delle conoscenze.
The authors have nothing to disclose.
TKMcG è sostenuto da una borsa di studio dal Canadian Thoracic Society.
CONTRIBUTO DEGLI AUTORI
Tutti gli autori hanno preso parte alla concezione del manoscritto. Inoltre, TKMcG avviato il progetto, raccolto risultati sperimentali, ha contribuito alla stesura del manoscritto e la sua revisione critica. AR raccolti e analizzati i risultati sperimentali, ha redatto il manoscritto e ha contribuito alla sua revisione critica. LF raccolti risultati sperimentali e ha contribuito alla revisione critica del manoscritto. TFS e JGM contribuito alla revisione critica del manoscritto.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Moria MC31 forceps, serrated-curved | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Spring scissors-2.5 mm blades, straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Non-sterile blunt needle (18g x ½”) | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Endotracheal cannula |
Non-sterile 5-0 silk suture | Seraflex | IDI58000 | |
Phosphate buffered solution | Gibco | 14190-144 | |
15 ml conical tubes | Starstedt | SS-4001 | |
1 ml TB syringes | Becton Dickinson | 309626 | |
200 μl filter tips | Biosphere | 70.760.211 | |
EQUIPMENT | |||
flexiVent FX | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |