Det nuvarande protokollet ger en detaljerad steg-för-steg beskrivning av de förfaranden som krävs för att utföra mätningar av andningsorganen mekanik samt bedömning av luftvägarna lyhördhet för inhalerad metakolin i möss med användning av påtvingad svängning tekniken (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Kanada).
Den tvingades svängning teknik (FOT) är en kraftfull, integrativ och translationell verktyg tillåter experimentell bedömning av lungfunktion hos möss i en omfattande, detaljerad, exakt och reproducerbart sätt. Det ger mätningar av andningsorganen mekanik genom analys av tryck och volym signaler som förvärvats i reaktion på fördefinierade, liten amplitud, oscillerande luftflödet vågformer, vilka vanligtvis används vid patientens luftvägar öppning. Detta protokoll föreskrivs de steg som krävs för att adekvat utföra forcerade oscillationsmetoden mätningar i möss med användning av en dator-styrd kolv ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Kanada). Beskrivningen är uppdelad i fyra delar: förberedelser, mekanisk ventilation, lung mätningar funktion och analys av data. Den innehåller också information om hur man skall bedöma luftvägarna lyhördhet för inhalerad metakolin i sövda möss, en gemensam tillämpning av denna technique som även omfattar andra resultat och olika patologier lunga. Mätningar som erhållits i naiva möss samt från en oxidativ-stress driven modell av luftvägarna skador presenteras för att illustrera hur detta verktyg kan bidra till en bättre karakterisering och förståelse av studerade fysiologiska förändringar eller modeller sjukdom samt tillämpningar inom nya forskningsområden.
Tillräcklig karakterisering av de mekaniska egenskaperna i lungorna i små djur har blivit avgörande eftersom den spirande av musmodeller i luftvägarna vetenskap. När utförs med påtvingad svängning teknik (FOT), en teknik som också används på människor, dessa mätningar ger ett kraftfullt, integrativ och translationell metod att studera meningsfulla fysiologiska förändringar. FOT mätningar erhålles vanligen genom analys av tryck och volym signaler som förvärvats i reaktion till en fördefinierad, liten amplitud, oscillerande luftflödet vågform (även kallad störning eller insignal) appliceras på patientens luftvägar öppning 1. I sin enklaste form skulle en FOT störning vara en enda sinusformad vågform vid en väldefinierad frekvens. Mer komplexa störningar består typiskt av en överlagring av ett urval av specifik (ömsesidigt prime) frekvens vågformer som täcker ett brett spektrum. Nedbrytningen av den multi-frekvensin-och utsignaler i sina beståndsdelar med hjälp av Fouriertransformen möjliggör beräkning av andningsorganen ingångsimpedans (Zrs), dvs överföringsfunktionen mellan in-och utsignaler, vid varje frekvens som ingår i den störning 2. Därför medger FOT samtidig bedömning av andningsmekanik över ett område av frekvenser i en enda manöver 2. Montering avancerade matematiska modeller (t.ex. konstant fas Model 3) med impedansen uppgifter möjliggör då en uppdelning av svaret i luftvägarna (centrala och perifera) och lungparenkym vävnad beroende parametrarna 1, 3. Eftersom många faktorer som påverkar fysiologiska reaktioner (t.ex. andningsfrekvens, tidalvolym, lungvolym, övre luftvägarna, spontan andning insatser, tidpunkt för mätningarna) kontrolleras och kalibreras av mätsystemet och experimentella procedurer är 1 tekniken capmöjlighet att generera exakta och reproducerbara mätningar förutsatt att det utförs korrekt. Syftet med denna artikel är att ge en detaljerad, kronologisk beskrivning av det förfarande som krävs för att utföra sådana mätningar i möss. Protokollet består av fyra delar: förberedande steg (reagenser, utrustning och ämnen), mekanisk ventilation, lung mätningar funktion och analys av data. Exempel på representativa resultat av andningsorganen mekanik genereras med hjälp av en datorstyrd kolv ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Kanada) tillhandahålls. Dessa erhölls från naiva möss samt från en oxidativ-stress driven modell av luftvägarna skador kännetecknas av luftvägsinflammation, epitelcellskada och ökad luftvägarna lyhördhet för inhalerad aerosol metacholin 4. Även om detta protokoll används ofta för att bedöma luftvägskänslighet för inhalerad metakolin, sträcker den sig till andra resultat och various patologier inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), emfysem, lungfibros, lungskada samt transgena musmodeller av patologier som liknar mänsklig sjukdom. Forskningsresultat som använder detta verktyg kan bidra till en bättre karakterisering och förståelse av fysiologiska förändringar eller modeller sjukdom samt expansion till nya forskningsområden.
Den fortsatta undersökningen av luftvägarna dysfunktion eftersom det gäller astma och andra sjukdomar i lungorna förblir avgörande för förståelsen av bakomliggande sjukdomsmekanismer och utveckling av behandlingsalternativ. Användningen av möss till modellen luftvägssjukdom har varit viktigt att få förståelse i dessa sjukdomsmekanismer. När man överväger att utvärdera luftvägarna dysfunktion i ett ämne så liten som en mus, med tillförlitliga och exakta verktyg för att mäta lungfunktionen är kritisk. Dessutom har verktyg som kan ge insikter om placeringen av luftvägarna dysfunktion eller terapeutisk effekt är ovärderlig. Den FOT Tekniken kombinerar alla dessa attribut och ger ett kraftfullt, integrativ och translationell metod för att utvärdera fysiologiska förändringar.
För att lyckas med denna typ av mätning i möss, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt ett par steg, nämligen kalibrering av systemet, motståndet av endotracheala cannula, vilken typ av nebulisator (liksom dess operativa inställningar) placeringen av djuret och standardisering av lungvolym historia. Dessutom är det absolut nödvändigt för att erhålla giltiga datamängder att en persons andningssystem förblir passiv under mätningarna. Detta kan uppnås genom administrering av en muskel förlamande medel, som arbetar på ett djupt plan av anestesi eller genom hyperventilerar motivet att inducera apné (se tabell 1). Utredarna kan börja genom att bemästra systemet och dess operativsystem, om så önskas, med provningsbelastningar, samtidigt förvärva de kunskaper som krävs för mätningar i möss. Det skulle då vara logiskt att generera reproducerbara resultat i naiva djur innan de flyttar till sjukdom modeller eller möss. Eftersom en stor del av sjukdomen modeller i luftvägarna forskning innebär att utsätta djur för medel såsom allergener, toxiner, föroreningar, cigarettrök eller gaser, variationer i de erhållna resultaten med de MÄTNINGt teknik som beskrivs i den här artikeln kan därför påverkas av den använda exponeringen förfarandet. Standardisering av viktiga experimentella processer (t.ex. med datorstyrd exponering och mätsystem 6, 13, 14) skulle kunna ha en betydande inverkan på att minska variabilitet.
Exemplen presenteras i denna artikel utgör ett urval av typiska resultat från naiva och klor-exponerade möss experiment samtidigt belysa styrkor samt begränsningar av tekniken. Såsom framgår exempelvis i fig. 6, är den teknik som kan generera reproducerbara mätningar lungfunktionen. Medan liknande baslinjen resistansvärdena rapporterades mellan musstammar, olikheter i elastance dock observeras 15. Stora förändringar är också att vänta mellan spädbarn och möss vuxen 16. Som för andra in vivo fysiologiska bedömning, höga resultat precision, såsom thOSE genereras av FOT, kommer med en koncession om det naturliga tillståndet av ämnena. Denna princip, som kallas fenotypning osäkerheten principen 1, gäller för detta protokoll i den meningen att mätningarna måste göras i sövda, tracheotomised (eller oralt intuberade) och mekaniskt ventilerade patienter. En annan begränsning av tekniken kan observeras i figur 5D-5F där data inte är tillgängliga vid de högsta koncentrationerna för klor-exponerade gruppen eftersom passningen av konstant fas modell till data som är dålig över måttliga nivåer av bronkkonstriktion. Men, skulle allvarligt bronkokonstringerade djur bedömas genom att analysera Zrs direkt 15 eller med hjälp av tredje part efter analysprogram för att passa mer komplexa matematiska modeller, t.ex. med hänsyn till heterogenitet mekanisk funktion 17. Uteslutna datamängder kan också iakttas om djuret luftvägar inte är tillräckligt passive eller om resistansen hos kanylen är för hög. Som en tumregel bör motståndet av kanylen inte överstiga djurets resistens vid baslinjen. Att arbeta med en kanyl av större innerdiameter och / eller kortare längd bidrar till att minska kanylen motstånd. Slutligen kan den aktuella demonstrationen av FOT mätningar i möss uppfattas som en tidskrävande och därmed mindre effektiv metod eller mindre tillämpliga på longitudinella studier jämfört med mindre invasiva tekniker. Men de senare är förknippade med stor osäkerhet utifrån sina resultat och ses av många som bristfällig 1. Upprepade invasiva mätningar är möjliga i oralt intuberade djur, även om det tekniskt mer utmanande 17.
Från de givna exemplen visade resultaten är likvärdiga de två generationer av flexiVent systemet på att producera mätningar av andningsmekanik, liksom luftvägarna hyperreacvitet och överkänslighet mot inhalerad metakolin efter klor-exponering hos möss. När det används för att karakterisera eller förstå fysiologiska förändringar eller modeller sjukdom, den detaljerad mätning aspekt relaterad till tekniken kan bidra till att förlänga det nuvarande kunskapsläget.
The authors have nothing to disclose.
TKMcG stöds av ett studentship från den kanadensiska Thoracic Society.
FÖRFATTARE BIDRAG
Samtliga författare deltog i utformningen av manuskriptet. Dessutom TKMcG initierat projektet, samlade experimentella resultat, bidragit till skrivandet av manuskriptet och dess kritiska granskning. AR har sammanställt och analyserat experimentella resultat, utarbetade manuskriptet och bidragit till sin kritiska granskning. LF samlade experimentella resultat och bidragit till kritisk granskning av manuskriptet. TFS och JGM bidragit till kritisk granskning av manuskriptet.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Moria MC31 forceps, serrated-curved | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Spring scissors-2.5 mm blades, straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Non-sterile blunt needle (18g x ½”) | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Endotracheal cannula |
Non-sterile 5-0 silk suture | Seraflex | IDI58000 | |
Phosphate buffered solution | Gibco | 14190-144 | |
15 ml conical tubes | Starstedt | SS-4001 | |
1 ml TB syringes | Becton Dickinson | 309626 | |
200 μl filter tips | Biosphere | 70.760.211 | |
EQUIPMENT | |||
flexiVent FX | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |