Her presenterer vi en elektrofysiologisk metode basert på solid støttet membraner med fokus på sine søknader om karakterisering av electrogenic membran transportører.
Den elektrofysiologisk metoden vi presenterer er basert på et solid støttet membran (SSM) består av en octadecanethiol lag chemisorbed på en gull belagt sensor chip og en fosfatidylkolin monolag på toppen. Denne sammenstillingen er montert i en kyvette inneholdende referanseelektroden, et klorert sølvtråd.
Etter adsorpsjon av membran fragmenter eller proteoliposomes inneholdende den membran protein av interesse, er en rask utveksling løsning som brukes for å indusere transport aktivitet av membranproteinet. I de enkle løsningen utveksling protokoll to løsninger, er en non-aktivering og en aktiviserende løsning, trengte. Strømningen styres av trykkluft og en ventil-og rør-system innenfor et Faraday-bur.
Kinetikken av den electrogenic transport aktivitet oppnås via kapasitiv kopling mellom SSM og proteoliposomes-eller membran-fragmenter. Metoden er derfor gir bare transient strømninger. Toppspenningen representerer den stasjonære transport aktivitet. De tidsavhengige transporter strømninger kan rekonstrueres ved krets analyse.
Denne metoden er spesielt egnet for prokaryotiske eller eukaryotiske transportører transportører fra intracellulære membraner, som ikke kan bli undersøkt av patch clamp eller voltage-clamp-metoder.
Her kan vi demonstrere en ny elektrofysiologisk tilnærming basert på et solid støttet membran (SSM) for karakterisering av electrogenic membran proteiner.
Den faste bærer består av et tynt lag gull på en glass-slide, sensorbrikken. Den hydrofile gull overflaten blir brukt til å binde den tiol-gruppe med en alcanethiol reagens. Etterpå fullfører selfassembly av en fosfatidylkolin monolyer dannelsen av SSM.
For å måle electrogenic reaksjoner av membranproteiner, blir proteoliposomes-eller membran-fragmenter adsorberes til SSM (figur 1). Proteinet inneholdende membranen og SSM deretter danne et kapasitivt koblet membransystem. Derfor kan lade translokasjon ved at proteinet inneholdende membran påvises ved kapasitiv kobling via SSM. Denne metoden gir bare forbigående strømninger. Toppspenningen representerer den stasjonære transport aktivitet. Den tidsavhengige transporter currents kan rekonstrueres ved krets analyse.
I sensorbrikken er montert i en kyvette system (figur 2). Kyvetten har en sylindrisk cuvette volum på 17 mL (netto volum med o-ring montert). En fjær kontaktstiften oppretter kontakten til forsterkeren. Et utløp kontakten er skrudd fast til toppen av hoveddelen og bærer referanse elektrode, en klorert sølvtråd.
Kyvetten er montert i et Faraday-bur. Den er koblet til en fluidledning, som brukes for å indusere transport aktiviteten til membranproteinet som reaksjon på en hurtig løsning utveksling (figur 3). I de enkle løsningen utveksling protokoll to løsninger, er en non-aktivering og en aktiviserende løsning, nødvendig. Flyten styres av trykkluft med en ventil kontroll programvare på en datamaskin eller manuelle brytere på et grensesnitt boksen.
En. Fordeler med SSM-basert electrophysiology sammenlignet med konvensjonelle fremgangsmåter
SSM-baserte elektrofysiologi har vist seg som et verdifullt verktøy for elektrofysiologisk verktøykasse. Det er spesielt nyttig i tilfeller der konvensjonen elektrofysiologi, nemlig patch klemme og spenning klemme metoder, ikke kan brukes: Bortsett fra noen få unntak bakterielle transportører ikke kan undersøkes ved hjelp av spenning klemme eller patch clamp metoder på grunn av den lille størrelsen på bakterier og fordi de er vanskelig å uttrykke i mammalske celler eller oocytter. Men også fysiologisk relevante pattedyr transportører kan undersøkes. I dette tilfellet SSM-baserte elektrofysiologi er attraktivt for transportører fra intracellulære membraner og for screening programmer i medisiner på grunn av sin robusthet og dets potensial for automatisering.
SSM-basedUsing konvensjonell elektrofysiologi, tid løst karakterisering av transporters er utfordrende. Ettersom omsetningen av transportører er en lav 'gigantisk patch "eller en" hel celle "-konfigurasjon er nødvendig, noe som har en iboende lav tidsoppløsning i en løsning utveksling eksperiment. Komplikasjonen kan overvinnes ved hjelp fotolytisk underlaget utgivelse. Det er imidlertid bare et begrenset antall underlag egnet for denne tilnærmingen. Her den raske løsningen utveksling ved SSM tilbyr en unik mulighet til å utføre elektrofysiologiske studier med høy tid oppløsning ved hjelp av vilkårlige underlag.
2. Begrensninger og kritiske trinn
I motsetning til patch clamp og voltage-clamp-teknikker, kan SSM-basert electrophysiology ikke benyttes for å påføre et potensiale. Transporter karakterisering er derfor begrenset til transport modi som ikke er avhengige av en membran potensial.
Generelt har SSM-baserte elektrofysiologi ingen begrensninger angående type (electrogenic) transporter. Men spenning clAmp eller patch clamp metoder kan ha fordeler, hvis intracellulære komponenter som bindende proteiner er nødvendig for protein-funksjonalitet.
Begrensninger kan oppstå, hvis løsning utveksling skaper store artefakt strømninger. Dette skjer når substratet interagerer sterkt med SSM som i tilfelle av lipofile forbindelser. Artefaktregioner kontroller kan brukes for å korrigere de målte signaler. Videre høy salt bakgrunn i alle måle-buffere kan brukes til å redusere gjenstander. Men i tilfeller hvor størrelsen på gjenstanden er sammenlignbar med den protein-signal, er det nesten umulig å isolere protein-relaterte signaler fra gjenstanden. Heldigvis høye gjenstander er uvanlig i en optimalisert løsning utveksling.
Det er noen skritt som er kritiske for en vellykket realisering av en SSM-baserte elektrofysiologi eksperiment. Fremstillingen av proteinprøven er den viktigste delen. Hvis proteoliposomes brukes, må du passe på reconstitution Prosessen resulterer i et rent, reproduserbar prøve av et tilstrekkelig LPR og transportøren er orientert på riktig måte. LPR kan kontrolleres ved å fryse brudd elektronmikroskopi og orientering av en ELISA eksperiment hvis antistoffene er tilgjengelig.
Bruk kun en SSM som viser optimale parametre for ruger protein prøven. Injeksjonen av proteinet er et annet kritisk punkt. Sonikering er viktig og luftbobler bør unngås under injeksjonen. Etter at prøven inkubering målingene selv er kritisk, fordi luftbobler vil fjerne det adsorberte protein prøven fra sensorbrikken. Derfor alltid fjerne luftbobler etter endring løsninger. Ikke desto mindre et signal trekk kan forekomme. For å korrigere en mulig signal trekk, er det viktig å oppnå trekk kontroller under eksperimentet.
3. Spesialiserte Systems
SSM-oppsett kan endres i henhold til sin søknad. Videre ther er helt forskjellige, høyt spesialiserte oppsett tilgjengelig.
Det er mulighet for å måle protein signaler i henhold asymmetriske forhold, for eksempel under en pH gradient. For å etablere asymmetriske buffer komposisjoner i og utenfor proteoliposomes en tredje løsning, hvile løsning, har til å bli innført, og dette krever en dobbelt utveksling konfigurasjon. Her er en ytterligere treveisventil veksling mellom ikke-aktiverende og hviler løsninger er nødvendig.
For å øke tidsoppløsningen av systemet vi utviklet en alternativ strøm pathway mangler terminalen ventil, men ved anvendelse av en annen type av kyvetten. Her krysningspunktet mellom aktivering og ikke-aktiverende løsning er plassert inne i kyvetten, 3 mm foran SSM. Dette oppsettet er godt egnet for kinetisk analyse av rask transport prosesser. Det kunne vises at en tidsoppløsning så lav som 2 ms er mulig.
Kommersiell fully automatiserte systemer er tilgjengelig med sikte på en betydelig høyere gjennomstrømning for narkotika screening. En bevegelig enhet samler løsninger og injiserer dem på sensorens overflate i 96-brønners plater i en standard mikrotiterplate-format.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker J. Garcia-Celma, jeg Smirnova og R. Kaback for bidrag til Lacy målinger og E. Bamberg for støtte og nyttige diskusjoner.
Materials | |||
Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
O-rings | Seal Science Inc. | ||
Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Amplifier | Keithley | 427 | |
Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
Regeants | |||
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |