Summary
כאן אנו מציגים שיטת אלקטרו מבוססת על ממברנות נתמכות מוצקות עם דגש על היישומים שלה לאפיון של המובילים בממברנה electrogenic.
Abstract
שיטת אלקטרו אנו מציגים מבוססת על קרום מוצק נתמך (SSM) המורכב משכבת octadecanethiol chemisorbed על שבב חיישן מצופה זהב וmonolayer phosphatidylcholine על העליונה. מכלול זה הוא רכוב לתוך מערכת קובט המכילה אלקטרודה השוואתית, חוט כסף עם כלור.
לאחר הספיחה של קרום שברים או proteoliposomes המכיל חלבון הקרום של עניין, משמש חילופי פתרון מהירים כדי לזרז את פעילות ההובלה של חלבוני הקרום. בפתרונות החליפין הפתרון יחידים שני הפרוטוקול, אחד שאינה הפעלה והפעלת פתרון אחד, יש צורך. הזרימה נשלטת על ידי מערכת שסתום וצינור אוויר דחוס ובתוך כלוב פאראדיי.
קינטיקה של פעילות התחבורה electrogenic מתקבלת באמצעות צימוד קיבולי בין SSM וproteoliposomes או שברים בממברנה. השיטה, אם כן, מניבה רק transienזרמים לא. השיא הנוכחי מייצג את פעילות התחבורה הנייחת. ניתן לשחזר את זרמי טרנספורטר התלויים בזמן ניתוח על ידי מעגל.
שיטה זו מתאימה במיוחד למובילי פרוקריוטים או המובילים אוקריוטים מקרומים תאיים, שאינו יכול להיחקר על ידי מהדק תיקון או שיטות מהדק מתח.
Introduction
כאן אנו מדגימים גישת אלקטרו חדש המבוססת על קרום נתמך מוצק (SSM) לאפיון של החלבונים בממברנה electrogenic.
התמיכה מוצקה מורכבת משכבה זהב דקיקה בשקופית זכוכית, שבב החיישן. משטח הזהב הידרופילי משמש כדי לאגד את קבוצת תיאול של מגיב alcanethiol. לאחר מכן, selfassembly של monolyer phosphatidylcholine משלים את היווצרות SSM.
כדי למדוד את תגובות electrogenic של חלבונים בממברנה, או שברי proteoliposomes קרום adsorbed לSSM (איור 1). החלבון המכיל קרום וSSM אז ליצור מערכת קרום מצמידים capacitively. לכן, טרנסלוקציה תשלום בקרום המכיל חלבון יכולה להיות מזוהה על ידי צימוד קיבולי דרך SSM. שיטה זו מניבה רק לזרמי מעבר. השיא הנוכחי מייצג את פעילות התחבורה הנייחת. מ"ק טרנספורטר התלוי הזמןניתן לשחזר rrents על ידי ניתוח מעגל.
שבב החיישן מותקן במערכת קובט (איור 2). יש קובט נפח קובט גלילי של 17 μl (נפח נטו עם O-טבעת רכוב). פינים האביב יוצרים קשר קשר למגבר. מחבר לשקע מוברג לחלק העליון של החלק העיקרי ונושא את האלקטרודה ההפניה, חוט כסף עם כלור.
קובט הוא רכוב בכלוב פאראדיי. הוא מחובר למסלול נוזל, המשמש כדי לעורר את פעילות ההובלה של חלבוני הקרום בתגובה לחילופי פתרון מהירים (איור 3). בפתרונות החליפין הפתרון יחידים שני הפרוטוקול, אחד שאינה הפעלה והפעלת פתרון אחד, נדרשים. הזרימה נשלטת על ידי אוויר דחוס באמצעות תוכנת בקרת שסתום במחשב או בוררים ידניים בתיבת ממשק.
Protocol
1. התקנתו של מנגנון לאלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM
פרטים ניתנים בשניים מהפרסומים הטכניים שלנו, אשר כוללים גם ציורים ותצלומים של cuvettes סכמטיים ולהגדיר 1, 2. תצורות חליפין פתרון אחרות ופרוטוקולי תזרים הם דנו גם בשיטת הנייר 2 שלנו.
בחלק הבא נוסיף כמה שיפורים אחרונים ופרטים טכניים שיש בם שייכות ישירה למצגת וידאו.
שסתום בקרה ורכישת נתונים
התיבה מכילה ממשק USB ממשק מסחרי דיגיטלי פלט / קלט אנלוגי (6009 מכשירי NI USB הלאומיים) ואת מנהלי התקנים שסתומים. היא שולטת על זרימת הפתרון, והוא אחראי לרכישת נתונים. שסתומים בדרך כלל מונעים עם 12 V. עם זאת, עבור מהר מיתוג יכולים להיות מונעים את השסתומים עם מתח של עד 18 ו 'בסרטון אנו משתמשים V אספקת חשמל 12. </ P>
המעגלים נהג הסתום יכולים לפעול ארבעה שסתומים. זה היה מיוצר על ידי הסדנה של מכון מקס פלנק לביופיסיקה. יכול להיות נשלט על ידי מחשב או באופן ידני באמצעות מתגים שסתום בפנל הקדמי. האחרון הוא נוח לשטיפה וניקוי-נהלים. בזמן מדידה, תיבת הממשק היא מבוקרת מחשב באמצעות שליטת סתום ותוכנת רכישת נתונים (SURFE תוכנת R 2, IonGate Biosciences).
2. הכנות
בסעיף זה בפרוטוקולים השונים להכנת ניסוי electrophysiology מבוסס SSM מוזכרים.
2.1 ביצוע פתרון השומנים להיווצרות SSM
- מערבבים 25 Octadecylamine μl (5 מ"ג / מ"ל בכלורופורם) ו375 Diphytanoylphosphatidylcholine μl (20 מ"ג / מ"ל בכלורופורם) בבקבוקון גלאס.
- שימוש במאייד סיבובי וזרימת גז חנקן רציפה, מתאדה לכלורופורםכ -30 דקות.
- הסר את השומנים מקירות בקבוקון הזכוכית על ידי טלטול עם 500 μl של n-decane. ריכוז השומנים הסופי הוא 15 מ"ג / מ"ל עם 1:60 (w / w) octadecylamine.
- מעבירים את הפתרון לאחסון בקבוקון הזכוכית. אחסן את פתרון השומנים בדם ב -20 ° C.
2.2 הכלרה של האלקטרודה ההתייחסות
האלקטרודות התייחסות צריכה להיות כלור במרווחים זמן קבוע עקב שחיקה.
- הסר את המשענת של שכבת silverchloride הישנה באמצעות נייר זכוכית עדינה לפני תהליך כלורינציה.
- מניחים את חוט הכסף יחד עם אלקטרודה פלטינה לפתרון חומצה הידרוכלורית 1 M וchlorinate במשך 15 דקות ב 0.5 mA. לאחר שסיים את הכלרה, חוט הכסף משנה את צבעיו לצבע אפור כהה אחיד.
2.3 הכנת גשר ג'ל polyacrylamide
- להכין תמיסה המכילה 100 מ"מ KPI ב-pH = 7, 100 מ"מ KCl ו6Acrylamid%.
- הוסף APS 0.3% (10% מניות) ו0.6% TEMED וזמן קצר לערבב את הפתרון עם טפטפת.
- מייד לאחר ערבוב הפתרון, השתמש פיפטה להזריק 30 μl של התערובת לתוך המכל גשר ג'ל הריק. זה חשוב כדי למנוע בועות אוויר בזמן ההזרקה.
- במהלך זמן דגירה של 20 דקות ג'ל polymerizes.
- לאחר פילמור גשר הג'ל מאוחסן בפתרון (100 מ"מ KPI 7-pH, 100 מ"מ KCl). כדי להאריך את תוחלת החיים של גשר ג'ל הפתרון מאוחסן ב 4 ° C.
2.4 הכנה של פתרונות המדידה
בשל האינטראקציה החזקה של מומסים עם SSM, חפצים חשמליים נוצרים כאשר פתרונות של הרכב שונה הם החליפו. לכן, ההכנה של פתרונות היא שלב קריטי. לנקוט באמצעי הזהירות הבא במהלך תהליך הכנת הפתרון ללמזער חפצי חליפין פתרון.
- הפוך ללא הפעלה והפעלת פתרונות מצרור אחד, להתאים את ה-pH וחוזק יוני.
- רקע מלח גבוה עוזר להפחית חפצי חליפין פתרון.
- מחלקים את הפתרון אצווה לשני כרכים.
- הוסף את מתחם ההפעלה להפעלת הפתרון. השתמש במתחם מפצה בפתרון שאינו המפעיל לשמור osmolarity וחוזק יוני של שני פתרונות דומים ככל האפשר.
- אם פתרונות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס, לוודא שכל פתרונות הגיעו טמפרטורת חדר לפני תחילת מדידה, משום שאפילו הבדלים קטנים בטמפרטורה יכולים לייצר חפצים.
3. ניסוי Electrophysiology מבוסס SSM
כאן אנו מציגים פרוטוקול טיפוסי לניסוי אלקטרו מבוסס SSM.
3.1 הכנת תוכנית ההתקנה SSM
בעוד הגדרת SSM אינה בשימוש הצינורות מלאים ב30% אתנולפתרון / מים כדי למנוע התפתחות חיידקים.
- שטוף את המערכת עם מים טהורים כדי להסיר אתנול מהצינור לפני ההרכבה קובט. להחליף את מכולות אתנול עם מיכלי מים. שימוש בלחץ גבוה (0.6-1.0 בר) לנקות את המערכת עם 20-30 מיליליטר מים.
- חזור על תהליך הניקוי באמצעות חיץ 100 מ"מ KPI ב-pH 7.6 או פתרון שאינו מפעיל.
- ודא שאין בועות אוויר להישאר במערכת הנוזל.
3.2 הרכבה קובט
- צרף O-טבעת לאלקטרודה ההשוואתית
- קח את גשר ג'ל מפתרון האחסון ולחבר את האלקטרודה ההפניה.
- מלא מראש המחבר לשקע עם חיץ ללא הפעלה, הכנס O-טבעת ולחבר את גשר ג'ל כדי להשלים את מכלול אלקטרודה ההשוואתית. קח טיפול מיוחד שאין בועות אוויר בצומת של גשר ג'ל ומסלול זרימת הפתרון לשקע.
- Preassemble חלק העיקרי של cuveטטי ידי הוספת סיכת אביב קשר (חיבור למגבר), את צינור היניקה (חיבור לשסתום המסוף), O-הטבעת (איטום עבור SSM) ואת הברגים.
- השימוש בפינצטה, לקחת את שבב החיישן מתוך פתרון האחסון (octadecanethiol 10 מ"מ באתנול).
- בעזרת פיפטה, לשטוף את הפתרון שנותר עם כ. 5 מ"ל של אתנול טהור.
- ייבש את האלקטרודה בגז חנקן.
- הנח את שבב החיישן במדויק על חלק הבסיס של קובט, כך שהכניסה של שעמם את החלק העיקרי של קובט מופנה לאזור הפעיל המעגלי של החיישן.
- הוסף μl 1 של פתרון השומנים בדם לאזור הפעיל של שבב החיישן. ודא, ששכבת הזהב מכוסה באופן מלא על ידי השומנים בדם.
- מייד לאחר הוספת פתרון השומנים בדם, לסגור את קובט על ידי הוספת החלק העיקרי preassembled.
- לפני ההרכבה קובט לתוך כלוב פאראדיי, כדי להיות בטוח שכל המשטחים הם יבשים לחלוטין.
- מחוליתECT המגבר לפין ליצירת קשר ואת צינור יניקת האביב לשסתום המסוף. לאחר מכן לתקן קובט עם הברגים בתוך כלוב פאראדיי.
- הברג את המחבר לשקע לחלק העליון של קובט. סוף סוף לחבר את צינור היציאה למחבר לשקע והמחולל המתח לאלקטרודה ההשוואתית.
- מייד לאחר ההרכבה קובט לשטוף את המערכת עם חיץ ב0.6 בר. זה מוביל להיווצרות ספונטנית SSM.
3.3 פרמטרים קרום מדידה
כדי לבדוק את איכות SSM, קיבול ומוליכות נמדדים באמצעות מחולל הפונקציה.
- באמצעות מחולל הפונקציה, להחיל מתח DC 100 mV למדוד את המוליכות.
- חשב את המוליכות: הריקבון הנוכחי מראה טעינה של קבל הממברנה. לאחר הקבל טעון באופן מלא את התשואות הנוכחיות מדדו את מוליכות הקרום באמצעות חוק אוהם. לשם פשטות אנו משתמשים מ"קrrent 1 שניות לאחר המתח החשמלי כדי לחשב את מוליכות G = אני / U.
- החל מתח AC משולש של 50 mV שיא לשיא האמפליטודה ותדירות של 0.5 הרץ למדוד את הקיבול.
- חשב את הקיבול: המשרעת של הגל המרובע הנוכחי המתקבל מייצגת את זרמי הטעינה של הקבל. C הקיבול שווה למטען המועבר ש = IΔt מחולק ΔU = 100 mV. (ΔU הוא פי שניים מהמתח להחיל של 50 mV כי אני הוא הבדל השיפוע החיובי מינוס שלילי הנוכחי של המתח המשולש.)
- לפקח על הפרמטרים החשמליים של הקרום שוב ושוב כל 10 דקות לכ. 30 עד 40 דקות, עד שהם הגיעו לערכים קבועים. לשטוף עם חיץ בין KPI בלחץ גבוה בטווח של כ 0.6-1 הבר.
- להעריך את איכות SSM: פרמטרים אופטימליים הם בטווח של 0.1-0.2 nS ו2-3.5 NF. מוליכות גבוהות מעל 0.8 קיבול nS והנמוך מתחת nF 1 מציינתשSSM לא כהלכה נוצר. קיבול גבוה מעל 4 nF עשוי לרמוז כי האזור הפעיל אינו מכוסה לחלוטין על ידי SSM.
- אם הפרמטרים אינכם נמצאים בטווח האופטימלי, הקרום אמור להיות מושלך וSSM אחר הכין, באמצעות שבב האלקטרודה מוכן טרי.
3.4 בדיקת חפצי חליפין פתרון
לאחר שבדקו את הפרמטרים בממברנה, שמאגרי המדידה צריכים להיבדק על חפצי חליפין פתרון.
- הכנס את מכולות הפתרון המתאימות למערכת הנוזל.
- הסר בועות אוויר ממערכת הנוזל, באמצעות שסתומים הידניים.
- שימוש בתוכנת רכישת נתונים בחר בפרוטוקול הזרימה ברצונך להשתמש בניסוי שלך.
- התאם את לחץ 0.6 בר ולהתחיל את המדידה.
- מלבד חפצי מיתוג השסתום מכאניים, יש למדוד אידיאלי אין זרמי ממצא או שהם צריכים להיות הרבה SMAller מאותות התחבורה החלבון הצפויים. אם חפצי חליפין פתרון הם נצפו, מנסים לייעל את הקומפוזיציות ו / או בהליך הכנת חיץ לפני שתמשיך את הניסוי.
3.5 הוספת מדגם החלבון
בדרך כלל proteoliposomes או שברים בממברנה מאוחסנים קפוא ב -80 ° C. למדידה אחת יש צורך aliquot של כ -30 μl.
- יש לשטוף את SSM עם פתרון שאינו מפעיל.
- להפשיר את דגימת החלבון על קרח.
- שלושה מחזורים של 10 שניות sonication לסירוגין עם הפסקות של 10 שניות קירור על קרח. Proteoliposomes הם sonicated באמצעות sonicator אמבטיה. לברי קרום משמש sonicator קצה (50W, 30 kHz, 1 מ"מ קוטר sonotrode, עצמת 20%, מחזור 0.5). לאחר שלב sonication האחרון לא לשים מדגם חזרה על קרח, אבל להזריק אותו מייד לקובט.
- הבריגו החוצה את שקע מחבר יחד עם התייחסות האלקטרודה assembly.
- בעזרת פיפטה, לשאוב 30 μl של מדגם החלבון ולעלות את קצה פיפטה לשקע נשא.
- פתח את השסתום הידני במסלול שאינו המפעיל למכל הפסולת ולהזריק את proteoliposomes לתוך נפח קובט. היזהר שלא להזרים אוויר לתוך נפח קובט עם החיישן.
- לפני הסרת קצה פיפטה, לסגור את השסתום הידני כדי למנוע זרימת פתרון נוספת.
- לאפשר לproteoliposomes כדי לספוג לSSM לזמן דגירה של שעות 1 ל -2. כמו כן ניתן לדגירת הלילה.
3.6 נוהל כללי של ניסוי מבוסס SSM
- לחמם את מאגרי המדידה בזמן, אם מאוחסן ב 4 ° C. כל מאגרי המדידה צריכים להיות בטמפרטורת חדר לפני תחילת המדידה, כדי למנוע חפצים.
- כאשר פתרונות שינוי, קודם לנקות את הצינורות בתוך מיכלי הפתרון עם רקמה הלא fuzzing, לאחר מכן להוסיף את הבקבוקים החדשים.
- לפני שמתחיל את המדידה, להשתמש בשסתומים הידניים כדי להסיר בועות אוויר, שיכול להתפתח מהליך שינוי.
- התאם את הלחץ רק לפני התחלת מדידה. אנו משתמשים באופן שגרתי בלחץ של 0.6 בר אשר בשסתום וצינור תצורה הספציפי שלנו מניבה קצב זרימה של כ 1.0 מ"ל / שנייה.
- יכולים להתבצע בכמה המדידות הראשונות ישר אחד אחרי השני ויש לדחות עד לשיא הנוכחי נשאר קבוע. אם פתרונות שונים ברמת חומציות נחוץ זמן דגירה של לפחות 3 דקות כדי להתאים את ה-pH הפנימי של proteoliposomes לפני התחלת המדידה.
- עכשיו להגדיר מוכן למדידה. כדי להפחית את הרעש לפחות 3 מדידות צריכים להיעשות בממוצע.
3.7 מדידות בקרה
סקירה אות בסדרה של מדידות יכולה להתרחש עקב פירוק חלבונים או הפסד של ספיחה. כל ניסוי SSM אני צריך nclude שליטה מוזנחת. הדבר נעשה על ידי מדידות חוזרות ונשנות עם פתרונות זהים. השליטה מינימאלית המוזנחת כלומר מדידה אחת בהתחלה ואחת בסוף הניסוי, תוך שימוש באותו הפתרון.
אנו ממליצים לעשות שליטה המוזנחת בתנאים שבו אתה מצפה משרעת הפסגה הגבוהה ביותר בניסוי. זה עושה את זה יותר קל לכמת את סקירה מהירה של האות.
סקירה האות ניתן לכמת על ידי השוואה של עוצמות השיא של שני הפקדים המוזנחים. הערך באחוזי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש כדי לתקן את האותות שנמדדו על ידי בהנחת תלות ליניארית של זמן מוזנח.
3.8 בקרות Artifact
אם אפשר לנסות לאמת את התוצאות שלך על ידי עיכוב החלבון של עניין לאחר הניסוי. אותות שנותרו הם כנראה חפצי חליפין פתרון. את האותות אז צריכים להיות מתוקנים לממצאים שנמדדו.
= "Jove_step"> 3.9 ילדה לאחר הניסוי
- שטוף את המערכת עם 20-30 מיליליטר מים טהורים ו20-30 מ"ל של אתנול / מים 30%. פתרון האתנולית מונע התפתחות חיידקים כאשר המערכת אינה בשימוש.
- לאחר תהליך הניקוי הזה, לשחרר את הלחץ מהמערכת וכבה את כל המכשירים.
- הסר את קובט מכלוב פאראדיי ולרדת בו. כל חלקי קובט ניתן לנקות עם מים ואתנול טהור, אם יש צורך, על ידי השימוש בsonicator אמבטיה.
- הנח את שבב החיישן בכוס גלאס עם אתנול טהור. Sonicate הכוס כ 1 עד 2 דקות באמצעות sonicator אמבטיה.
- ייבש את שבב החיישן מתחת לגז חנקן.
- אחסן את שבב חיישן מרחק של האור בפתרון האתנולית Octadecanthiol 10 מ"מ. לאחר זמן דגירה של כ -30 דקות שבב החיישן מוכן לשימוש חוזר.
Representative Results
עד עכשיו, electrophysiology מבוסס SSM שימש לאפיין יותר מ -20 מובילים, בעיקר ממוצא פרוקריוטים, למשל 3 Melb, NhaA 4 וPutP 5 (סיכם ב6). אבל גם מובילים אוקריוטים מקרומים תאיים, למשל ClC7 7, כמו גם תעלות יונים, למשל קולטן האצטילכולין ניקוטינית 8 נחקרו.
כאן אנו מציגים כדוגמה של כ מדידות הסוכר / H + cotransporter ייסי מחיידקי Escherichia באמצעות proteoliposomes עם לפחות 85% צד ימין מתוך אוריינטציה לייסי בLPR של 5 9, 10. אנו מתמקדים בשלבים העיקריים שהובילו למודל הקינטית מינימאלי של חלבון תחבורה זה.
1. אפיון אלקטרו של תחרת wildtype
הצעד הראשון הוא אפיון כללי של תגובת electrogenic על ידי מדידת ערכי pH שונים (
תלות pH של לייסי מציגה שתי תגובות electrogenic שונות. העליות הנוכחיות מצמידים capacitively בין חומציות pH 8.5 5 ו, אלא גם משנה את צורתו. תחת תנאים בסיסיים תחבורה מצב יציבה הוא ציין, בעוד שעבור pH חומצי מעריכה רק תגובה מהירה electrogenic נשארה. כדי להבדיל את אותות המצב יציבים מתגובות electrogenic מהר אנחנו משמשים ניתוח מעגל לשחזר זרמי טרנספורטר (איור 6).
ב-pH 7 אות monophasic הופכת biphasic. זה גם מצביע על כך שיש שתי תגובות electrogenic שונות. ההערכה היא מהתשלום הועבר (נפרד של האותות), יש שתי התגובות% ו -94% מelectrogenicity הכולל של מחזור התחבורה על 6.
ove_step "> 2. הקצאה מתגובות electrogenicכדי להקצות שתי תגובות electrogenic לשלבים מסוימים במחזור של תחרת התגובה, גרסת ייסי E325A נמדדה (איור 7). וריאנט זה רק מראה לקטוז חילופי אבל הוא חסר לכל מצבי התחבורה הפעילים, בשל העיכוב של שחרור פרוטון. האות של E325A ייסי מייצגת חולפת מהיר וקבועה לכל ערכי ה-pH שנמדד. הצורה והמשרעת של האות דומה לאות של wildtype ייסי בתנאים חומציים. בנוסף אנו צופים בשלב שלילי קטן אחרי זרם השיא במגמת ירידה, שהיא אופיינית לזרמי מעבר מהירים שנמדדו במערכות מצמידים capacitively. בגלל מחייב ושחרורו לקטוז הוא לא electrogenic, חולף מהר חייב לתאם עם מעבר קונפורמציה electrogenic בעקבות קטוז מחייב.
זה ידוע כי צעד שחרור הפרוטון הוא שיעור limiting למחזור ייסי במצב התחבורה מונע ריכוז השיפוע לקטוז. במקרה זה אנו מצפים לעלייה של שיעור התחבורה עם pH בסיסי, כי שחרור פרוטון הוא מועדף. זהו המקרה להובלת המצב היציב קורלציה אות של wildtype ייסי. יתר על כן זה יכול להיות מוצג על ידי מדידת שיפוע pH שרק את ה-pH הפנימי משפיעה על המצב היציב של התחבורה ייסי (לא פורסם). לכן תגובת electrogenic הגדולה יכולה להיות מוקצה לשלב שחרור הפרוטון.
3. מדידות לצורך הניתוח הקינטית
לאחר זיהוי של תגובות electrogenic לסירוגין מחירי התחבורה נקבעו באמצעות הגדרת SSM עם רזולוציה גבוהה של זמן כ -4.5 אלפיות שנייה. זה אפשרי רק בתנאים, כאשר תגובה אחת שולטת באות. במקרה זה ניתן לגזור את קבועי קצב מהזרמים החולפים תחת שיקול של הרזולוציה הזמן של האותות באמצעות איטרטיבי הפחות ריבועי דה אלגוריתם פיתול (איור 8). קבועי השיעור שנקבעו, כמו גם את המודל הקינטית מינימאלי המוצע (איור 9) ולבסוף שמשו לסימולציה של קינטיקה טרנספורטר. העקומות מדומה לשחזר את נתוני SSM אשר בנוסף מוכיח מודל קינטית.
איור 1. הגיאומטריה ספיחה של proteoliposomes על SSM. SSM נוצר על שבב חיישן, שקופיות זכוכית מצופים זהב מובנה. כדי למדוד את תגובות electrogenic של חלבונים בממברנה, או שברי proteoliposomes קרום adsorbed לSSM. שתי ממברנות ליצור מערכת מצמידים capacitively. זו הסיבה שרק לזרמי מעבר מזוהים.
tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
איור 2. SSM קובט נושא את החיישן ושבב אלקטרודה השוואתי. שבב החיישן הוא דחוקה בין בסיס קובט וראש קובט. אלקטרודה ההשוואתית מבודדת ממסלול הזרימה על ידי גשר מלח ג'ל polyacrylamide.
איור 3. מסלול נוזלים ומעגל חשמלי של התקנת SSM. בפרוטוקול חילופי הפתרון היחיד אחת בלבד שאינם מפעיל (NA) והפעלה אחת () פתרון הנדרש. הזרימה נשלטת על ידי שני שסתומים 2-way (V1) וסתום מסוף אחד (V2). בוררי סתום הקצה בין פתרונות שאינם הפעלה והפעלה, בימוי אחד מפתרונות לקובט ופתרון האחר למכל פסולת (W). שבב החיישן (SSM) מחובר למגבר (I / U), בעוד אלקטרודה ההשוואתית (AgCl) מחוברת לגנרטור הפונקציה (F) במעגל החשמלי החיצוני. מחשב (PC) ותיבת ממשק משמשים להפעלת שסתום ורכישת נתונים.
איור 4. זרמי מעבר נמדדו עם proteoliposomes ייסי wild-type לאחר 100 קפיצות ריכוז לקטוז מ"מ בערכי pH שונים. הפתרון ללא ההפעלה הכיל גלוקוז 100 מ"מ תוך פתרון ההפעלה הכיל לקטוז 100 מ"מ. כל פתרונות הוכנו במאגר פוספט אשלגן 100 מ"מ ב-pH המצוין עם DTT 1 מ"מ. לפרטים בדבר תנאי מדידה בזה ואת הנתונים הבאים עיינו 9 ו -10.
ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
איור 5. זרמי שיא מנורמלים ממוצע נמדדו עם proteoliposomes ייסי פראי מסוג שלאחר קפיצות ריכוז לקטוז בריכוזים שונים וערכי pH. ערכי m K מתקבלים מההתקפים היפרבולית.
איור 6. שחזור של זרמי טרנספורטר. הזרמים החולפים () המשמש לשחזר את זרמי טרנספורטר (B) נמדדו עם proteoliposomes ייסי wild-type לאחר 100 קפיצות ריכוז לקטוז מ"מ בpH 8.5 (כחול זכר) וה-pH 5.2 (אדום זכר). ב-pH 8.5 מחזור מתמשך הוא ציין אילו ב-pH 5.2 תגובה electrogenic מהירה מתרחשת. זה ברור הוא ציין בנוכחי המשוחזר (ב ').
files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" איור 7 "עבור: תוכן-width =" 4in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
איור 7. נוכחי חולף נמדד עם proteoliposomes ייסי E325A לאחר קפיצת ריכוז לקטוז 100 מ"מ ב-pH 5.2. גרסת ייסי זה מעוכב בשלב שחרור הפרוטון של מחזור התחבורה ולכן תחבורה לקויה. המרכיב השלילי הקטן ציין אופייני לזרמי מעבר מהירים שנמדדו במערכות מצמידים capacitively והיא נגרמת על ידי השחרור של קיבול הקרום לאחר תגובת electrogenic מהר. π0 קבוע הזמן שלו נקבע על ידי הקיבולים וconductances של המערכת (איור 1).
איור 8. זרמי מעבר נמדדו עם proteoliposomes ייסי פראי מסוג afteקפיצות r שונות לקטוז בריכוז ה-pH 5.2. בתנאים אלה אין תחבורה מצב יציבה הוא ציין, אבל מעבר קונפורמציה electrogenic על קטוז מחייב. הקו המקווקו מראה את פונקציית ההעברה המייצגת את ההחלטה בזמן של המערכת. הבלעה מראה את הנחישות של לסירוגין קבועי קצב מKobs הקבועים הנצפה השיעור עם כושר ההיפרבולי לנתונים. השיעור הקבוע שנצפו היה נחוש מהזרמים החולפים עם איטרטיבי הפחות ריבועי deconvolution אלגוריתם 10.
איור 9. מודל הקינטית למעגל של שני שלבי electrogenic ייסי. התגובה יכול להיות מזוהה ומאופיין במדידות SSM. תגובה חזקה electrogenic מייצגת ~ 94% מתזוזת המטען הכולל בתגובההמחזור נצפה רק בערכי ה-pH ניטראליים ובסיסיים. זה יכול להיות מוקצה לשלב שחרור הפרוטון (חץ כחול). צעד חלוש electrogenic הוא ציין ב-pH חומצי כאשר המחזור מתמשך של טבע מסוג ייסי מעוכב. אנחנו מוקצים התגובה הזו למעבר קונפורמציה electrogenic על קטוז מחייב, המייצג 6% מתזוזת המטען הכולל של מחזור התגובה.
Discussion
1. יתרונותיו של electrophysiology מבוסס SSM בהשוואה לשיטות קונבנציונליות
electrophysiology מבוסס SSM הוכיח את עצמו ככלי רב ערך של ארגז הכלים של אלקטרו. זה שימושי במיוחד במקרים בהם לא ניתן להחיל האמנה electrophysiology, כלומר תיקון מהדק ושיטות מהדק מתח,: מלבד כמה יוצאים מן הכלל נדיר שלא ניתן לחקור מובילי חיידקים באמצעות מהדק מתח או שיטות מהדק תיקון בגלל גודלו הקטן של חיידקים ובגלל הם קשים לבטא בתאים או בביציות יונקים. אלא גם מבחינה פיזיולוגית ניתן לחקור מובילי יונקים רלוונטיים. במקרה זה electrophysiology מבוסס SSM הוא אטרקטיבי למובילים מקרומים תאיים ועבור יישומי הקרנה בגילוי תרופות בגלל החוסן שלה והפוטנציאל שלה לאוטומציה.
electrophysiology, אפיון קונבנציונלי SSM basedUsing פעמי ייפתר של transporters הוא מאתגר. מאז המחזור של מובילים הוא נמוך "תיקון ענק" או נדרשת התצורה 'תא כולו', שבו יש החלטה בזמן מטבעו נמוך בניסוי חילופי פתרון. ניתן להתגבר על הסיבוך באמצעות שחרור מצע photolytic. עם זאת, רק מספר מצומצם של מצעים מתאימים לגישה זו. הנה חילופי הפתרון המהיר בSSM מציעים הזדמנות הייחודית לביצוע מחקרי אלקטרו עם רזולוציה גבוהה באמצעות מצעי זמן שרירותיים.
2. מגבלות ושלבים קריטיים
בניגוד לתיקון מהדק וטכניקות מהדק מתח, לא ניתן להשתמש בelectrophysiology מבוסס SSM ליישם את פוטנציאל. אפיון טרנספורטר מוגבל ולכן כדי להעביר מצבים שאינם מסתמכים על פוטנציאל הממברנה.
באופן כללי, יש electrophysiology מבוסס SSM אין מגבלות הנוגעות לסוג טרנספורטר (electrogenic). אבל CL מתחשיטות מהדק מגבר או תיקון יכולות להיות יתרונות, אם רכיבים תאיים כמו חלבונים מחייבים נדרשים לתפקוד חלבון.
מגבלות יכולות להתעורר, אם חילופי פתרון יוצרים זרמי ממצא גדולים. זה קורה כאשר מצע אינטראקציה חזק עם SSM כמו במקרה של תרכובות lipophilic. פקדי Artifact ניתן להשתמש כדי לתקן את האותות שנמדדו. יתר על כן רקע מלח גבוה בכל מאגרי המדידה יכול לשמש כדי להפחית את החפצים. אבל במקרים, שבו גודלו של החפץ דומה לאות החלבון, זה כמעט בלתי אפשרי לבודד אות הקשורה חלבון מהחפץ. למרבה המזל, חפצים גבוהים הם יוצא דופן בחילופי פתרון אופטימלי.
ישנם כמה צעדים שהם קריטיים למימוש המוצלח של ניסוי electrophysiology מבוסס SSM. הכנת מדגם החלבון היא חלק החשוב ביותר. אם נעשה שימוש בproteoliposomes, כדי להיות בטוח את המשוחזריםתהליך titution מניב מדגם נקי, לשחזור של LPR מספיק וטרנספורטר הוא מכוון בצורה הנכונה. ניתן לבדוק LPR על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים בר הקפאה וכיוון על ידי ניסוי ELISA אם נוגדנים זמינים.
השתמש אך ורק SSM אשר מציג פרמטרים אופטימליים לדוגרי מדגם החלבון. הזריקה של החלבון היא שלב קריטי אחר. Sonication הוא חיוני ויש להימנע מבועות אוויר בעת ההזרקה. לאחר הדגירה מדגם המדידות עצמו הן קריטיות, כי בועות אוויר תסיר את דגימת חלבון adsorbed משבב החיישן. לכן תמיד להסיר בועות אוויר לאחר שינוי פתרונות. עם זאת מוזנח אות יכול להתרחש. כדי לתקן מוזנח אות אפשרית, זה חיוני כדי להשיג את הפקדים מוזנחים במהלך הניסוי.
3. מערכות מיוחדות
ניתן לשנות SSM-ההתקנה לפי בקשתו. יתר על כן לאהנה מערכים שונים לחלוטין, מאוד מיוחדים זמינים.
קיימת האפשרות למדוד אותות חלבון בתנאים סימטריים, לדוגמה תחת שיפוע-pH. להקים חיץ קומפוזיציות סימטריות בתוך ומחוץ לproteoliposomes פתרון שלישי, הפתרון במנוחה, יש להיות הציג וזה דורש תצורת חילופי כפולה. כאן נדרש שלוש דרך שסתום נוסף מעבר בין פתרונות שאינם הפעלה ומנוחה.
כדי להגדיל את הרזולוציה הזמן של המערכת שפיתחנו מסלול זרימה חלופי חסרי שסתום המסוף, אך להשתמש בסוג זה של קובט שונה. כאן הצומת של הפעלה ופתרון שאינו מפעיל נמצאת בתוך קובט, 3 מ"מ מול SSM. הגדרה זו מתאימה גם לניתוח הקינטית של תהליכי הובלה מהירים. זה יכול להיות הראה כי ברזולוציה נמוכה כמו פעם 2 אלפיות שני אפשרית.
F המסחריully מערכות אוטומטיות זמינות מכוונים לתפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי עבור הקרנת סמים. יחידת מטלטלין אוספת פתרונות ומזריקה אותם על פני החיישן בצלחות 96, גם בפורמט צלחת microtiter סטנדרטי.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לג' גרסיה Celma, אני סמירנובה ור 'Kaback על תרומתו למדידות לייסי וא' במברג על תמיכה ודיונים מועילים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
| Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
| 2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
| Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
| Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
| Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| 100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
| O-rings | Seal Science Inc. | ||
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
| Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
| Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
| Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
| Amplifier | Keithley | 427 | |
| Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
| USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
| Regeants | |||
| 1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
| Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
| n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
| Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
| Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
| α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 | |
References
- Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
- Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K.
- Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
- Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
- Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
- Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
- Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
- Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
- Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K.
- Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).
