Här presenterar vi en elektrofysiologisk metod baserad på fastfasbundna membran med fokus på sina ansökningar för att karakterisera electrogenic membrantransportörer.
Den elektrofysiologiska metoden vi presenterar är baserad på en uppburen fast membran (SSM) bestående av ett skikt octadecanethiol kemisorberad på en guldbelagda sensorchip och en fosfatidylkolin monoskikt ovanpå. Detta aggregat är monterat i en kyvett innehållande referenselektroden, en klorerad silvertråd.
Efter adsorption av membranfragment eller proteoliposomer innehållande membran proteinet av intresse, är en snabb lösning för utbyte som används för att inducera transportverksamheten inom membranproteinet. I de enda lösning börsprotokollet två lösningar, är en icke-aktiverande och en aktiverande lösning behövs. Flödet styrs av trycksatt luft och en ventil och rörsystem inom en Faradays bur.
Kinetiken för electrogenic transportarbetet erhålls via kapacitiv koppling mellan SSM och proteoliposomer eller membranfragment. Metoden är därför endast ger transient strömmar. Den toppström representerar den stationära transportverksamhet. De tidsberoende transportören strömmar kan rekonstrueras genom krets analys.
Denna metod är särskilt lämpad för prokaryota transportörer eller eukaryota transportörer från intracellulära membran, som inte kan undersökas med patch clamp eller spänning metoder klämma.
Här visar vi en ny elektrofysiologisk metod som bygger på en uppburen fast membran (SSM) för karakterisering av electrogenic membranproteiner.
Den fasta bäraren består av ett tunt guldskikt på en glasskiva, sensorchipet. Den hydrofila guldytan används för att binda tiolgruppen i en alcanethiol reagens. Efteråt avslutar selfassembly av en fosfatidylkolin monolyer bildandet av SSM.
För att mäta electrogenic reaktioner av membranproteiner är proteoliposomer eller membranfragment adsorberas på SSM (Figur 1). Proteinet innehållande membran och SSM bildar då en kapacitivt kopplad membransystem. Därför kan laddning translokation hos det protein som innehåller membran detekteras genom kapacitiv koppling via SSM. Denna metod ger endast transienta strömmar. Den toppström representerar den stationära transportverksamhet. Den tidsberoende transportör currents kan rekonstrueras genom krets analys.
Sensorn chip är monterat i en kyvett-systemet (figur 2). Kuvetten har en cylindrisk kyvett volym på 17 l (nettovolym med O-ring monterad). En fjäder kontaktstift skapar kontakt till förstärkaren. Ett utlopp kontakt är fastskruvat ovanpå av huvuddelen och uppbär referenselektroden, en klorerad silvertråd.
Kyvetten är monterad i en Faradays bur. Den är ansluten till en fluidväg, som används för att inducera transport aktiviteten av membranprotein som svar på en snabb lösning för utbyte (figur 3). I de enda lösning börsprotokollet två lösningar, är en icke-aktiverande och en aktiverande lösning krävs. Flödet styrs med tryckluft med hjälp av en programvara ventilstyrning på en dator eller manuella växlar på ett gränssnitt rutan.
Ett. Fördelar med SSM-baserade elektrofysiologi jämfört med konventionella metoder
SSM-baserade elektrofysiologi har visat sig vara ett värdefullt verktyg i den elektrofysiologiska verktygslådan. Det är särskilt användbart i fall där konventionen elektrofysiologi, nämligen patch clamp och spänning metoder klämma, inte kan tillämpas: Bortsett från några få undantag bakteriella transportörer inte kan undersökas med hjälp av spänning klämma eller patch metoder klämma på grund av den lilla storleken av bakterier och eftersom de är svåra att uttrycka i däggdjursceller eller oocyter. Men också fysiologiskt relevanta däggdjurs transportörer kan undersökas. I detta fall SSM-baserade elektrofysiologi är attraktivt för transportörer från intracellulära membran och sålla bort ansökningar inom läkemedelsforskning på grund av dess robusthet och dess potential för automation.
SSM-basedUsing konventionell elektrofysiologi, tidsupplöst karakterisering av transporters är utmanande. Eftersom omsättningen av transportörer är låg en "gigantisk lapp" eller en "hel cell konfiguration behövs, vilket har en inneboende låg tidsupplösning på en lösning utbyte experiment. Den komplikation kan övervinnas med hjälp fotolytiska substrat release. Emellertid är endast ett begränsat antal substrat lämpade för detta tillvägagångssätt. Här snabb lösning utbyte vid SSM erbjuder en unik möjlighet att utföra elektrofysiologiska studier med hög tidsupplösning med godtyckliga substrat.
2. Begränsningar och kritiska stegen
I motsats till patch clamp-och spännings-tekniker klämma, kan SSM-baserad elektrofysiologi inte användas för att applicera en potential. Transporter karakterisering begränsas därför på transporter som inte är beroende av ett membran potential.
I allmänhet, har SSM-baserade elektrofysiologi inga begränsningar för den typ av (electrogenic) transportör. Men spänning clamp eller patch clamp metoder kan ha fördelar, om intracellulära komponenter som bindande proteiner krävs för proteiner fungerar.
Begränsningar kan uppstå, om lösningen utbyte skapar stora artefakt strömmar. Detta händer när substratet interagerar starkt med SSM som i fallet med lipofila föreningar. Artifact kontroller kan användas för att korrigera de uppmätta signalerna. Dessutom hög salt bakgrund i alla mät buffertar kan användas för att reducera artefakter. Men i fall där storleken av artefakten är jämförbar till proteinet signalen är det nästan omöjligt att isolera proteinet relaterade signalen från artefakt. Lyckligtvis höga artefakter är ovanligt i en optimerad lösning utbyte.
Det finns några steg som är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av en SSM-baserade elektrofysiologi experiment. Framställningen av proteinet provet är den viktigaste delen. Om proteoliposomer används, vara säker på reconstitution förfarande ger en ren, reproducerbar prov av en tillräcklig LPR och transportören är orienterad på rätt sätt. LPR kan kontrolleras genom frys fraktur elektronmikroskopi och orientering genom en ELISA-experiment om antikroppar är tillgängliga.
Använd endast en SSM som visar optimala parametrar för inkubering av proteinet provet. Injektionen av proteinet är ett kritiskt steg. Sonikering är viktigt och luftbubblor bör undvikas under injektionen. Efter provet inkubation mätningarna själv är kritisk, eftersom luftbubblor kommer att ta bort den adsorberade proteinprovet från sensorchipet. Därför alltid bort luftbubblor efter byte lösningar. Icke desto mindre en signal nedsliten kan förekomma. För att korrigera en eventuell signal nedsliten, är det viktigt att åstadkomma nedslitna kontroller under experimentet.
Tre. Specialiserade system
SSM-Setup kan modifieras enligt sin ansökan. Dessutom var THär är helt olika, högt specialiserade inställningar tillgängliga.
Det finns möjlighet att mäta protein signaler enligt asymmetriska förhållanden, t.ex. inom ramen för en pH-gradient. Att etablera asymmetriska buffertkompositioner inom och utanför proteoliposomer en tredje lösning, den vilande lösningen, måste införas och detta kräver en dubbel utbyte konfiguration. Här ytterligare trevägsventil växling mellan icke-aktiverande och vila lösningar krävs.
För att öka tiden upplösningen av det system vi utvecklat ett alternativt flöde bana saknar terminalen ventilen, men använder en annan typ av kyvetten. Här korsningen av aktiverande och icke-aktiverande lösningen ligger inne i kyvetten, 3 mm framför SSM. Denna inställning är väl lämpad för kinetisk analys av snabba transportprocesser. Det kunde visas att en tidsupplösning så lite som 2 ms är möjlig.
Kommersiell fUlly automatiserade system finns tillgängliga som syftar till en betydligt högre genomströmning för narkotika screening. En rörlig enhet samlar lösningar och sprutar dem på sensorytan i 96-brunnars plattor i en standard mikrotiterplattformat.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar J. Garcia-Celma, jag Smirnova och R. Kaback för bidrag till de Lacy mätningar och E. Bamberg för stöd och bra diskussioner.
Materials | |||
Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
O-rings | Seal Science Inc. | ||
Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Amplifier | Keithley | 427 | |
Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
Regeants | |||
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |