Vi udviklet og valideret en lille fodaftryk vifte af miniature kemostater bygget af let tilgængelige dele til en lav pris. Fysiologiske og eksperimentel udvikling skyldes svarede til større volumen kemostater. Den ministat arrayet giver en kompakt, billig og tilgængelig platform for traditionelle kemostat eksperimenter, funktionelle genomics og kemiske screening applikationer.
Kemostater er kontinuerlige kultur systemer, hvor cellerne dyrkes i et stramt kontrolleret, kemisk konstant miljø, hvor kultur tæthed er begrænset ved at begrænse specifikke næringsstoffer. 1,2 Data fra kemostater er særdeles reproducerbar til måling af kvantitative fænotyper, da de giver en konstant vækstrate og miljø ved steady state. Af disse grunde har kemostater blevet nyttige redskaber for finskala-karakterisering af fysiologi gennem analyse af genekspression 3-6 og andre egenskaber ved kulturer ved steady state ligevægt. 7 Langsigtede eksperimenter i kemostater kan fremhæve bestemte baner at mikrobielle populationer udsteder under adaptive evolution i et kontrolleret miljø. Faktisk har kemostater været anvendt til eksperimentel udvikling, siden deres opfindelse. 8 En fælles resulterer i udviklingen eksperimenter er for hvert biologisk replikat at opnå et unikt repertoire af mutationer. 9-13 Denne mangfoldighed antyder, at der er meget tilbage at blive opdaget ved at udføre evolution eksperimenter med langt større gennemløb.
Vi præsenterer her for konstruktion og drift af en relativt simpel, billig vifte af miniature kemostater-eller ministats-og validere deres anvendelse i bestemmelse af fysiologi og i evolution eksperimenter med gær. Denne fremgangsmåde indebærer vækst af snesevis af kemostater løbe en enkelt multiplex peristaltisk pumpe. Kulturerne holdes ved en 20 ml arbejdsvolumen, der er praktisk for en lang række applikationer. Det er vores håb, at stigende gennemløb, faldende omkostninger, og give detaljerede bygge-og driftsvejledning også kan motivere forskning og industriel anvendelse af dette design som en generel platform for funktionelt karakterisering et stort antal stammer, arter og vækstparametre, samt genetisk eller lægemiddel-biblioteker.
Dynamikken i mikrobiel vækst og udvikling er afgørende for mikrobiologi, økologi, genetik og bioteknologi. Den mest almindelige fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer er i batch, hvor celler podes ved lav tæthed i næringsrigt medium og dyrket til mætning. Selvom ligetil at udføre med standard laboratorieudstyr, oplever batchkulturer en svingende kemisk miljø og tilsvarende skiftende cellulær fysiologi. Denne heterogene vækstmiljø kan resultere i sekundære vækst og stress effekter, som kan maskere subtile fysiologiske forskelle. Eksperimentel udvikling ved seriel batch overførsel kan vælge for komplekse blandinger af vækst-fase-specifikke subpopulationer, komplicerer forsøg på at forbinde tilpasninger til de særlige selektive betingelser. Måling af kvantitative fænotyper kan være vanskelig på grund af støj fra upræcis prøve timingen og variationen i funktioner såsom halter tid. Kontinuerlige kulturer et alternativvækst ordning, hvor celler kan reproducerbart dyrket i et kemisk homogent miljø ved en defineret væksthastighed at opnå en fysiologisk steady state. På grund af disse fordele, ofte studier af eksperimentel udvikling og karakterisering af cellulær tilstand anvender et kontrolleret miljø på kontinuerte kulturer som kemostat. 14
Vurdering af disse fordele har ført til en genopblussen interesse for kemostat kulturer. 15 Da de blev indført i 1950, har 1,2 kemostat systemer blevet udviklet til at fungere på forskellige skalaer i området fra l til mikroliter, og for en række anvendelser. 16 -19 Disse forskellige designs, der spænder fra kommercielt produceret bioreaktorer til glassblown fartøjer til brugerdefinerede MicroFluidics platforme, deler de generelle designprincipper. En kultur kammer omrøres og beluftes (normalt ved at boble luft igennem det), og mikrober indeholdt deri holdes homogenly dispergeret i dyrkningskammeret på alle tidspunkter. Frisk medium med defineret sammensætning tilsættes kontinuerligt og af tilsætningshastigheden styrer vækst og påvirker det kemiske miljø, der opleves af kulturen. Et overløb sætter kulturen volumen i væksten røret, og gennem dette overflow kulturen vil blive udtaget ved samme hastighed, hvormed frisk medium kommer ind. På denne måde kulturer hurtigt nå en fysiologisk ligevægtstilstand, hvor mange biologiske parametre forbliver konstante. Trods fordelene ved kemostater og rapporter fra disse forskellige platforme i litteraturen, er omfattende vedtagelse været begrænset af problemer med at bygge og drive disse systemer, og høje omkostninger, der er forbundet med kommercielle muligheder. Derudover beskrivelser af, hvordan man fremstiller og anvender disse enheder kan være uigennemsigtig.
Vi præsenterer designs og instruktioner til brug af et lille fodaftryk vifte af miniature kemostater bygget af let tilgængelige dele til en lav pris. Vi obsErve yderst konsekvente eksperimentelle parametre og reproducerbare resultater, når man sammenligner vores enhed til indberettede data for gær dyrket i større mængder kommercielle bioreaktorer. Dette omfatter reproducerbarhed af cellulær fysiologi set gennem nå steady-state ligevægt inden for 10-15 generationer, og få lignende kultur tætheder ved ligevægt. Derudover genekspression mønstre er overensstemmelse mellem ministats og en kommerciel større volumen platform. Stabilitet af fortyndingshastighed, optisk tæthed og reproducerbarhed af genekspression mellem tre gentagne kulturer viser robustheden af vores platform. Vi viser også, at de samme adaptive mutationer opstår i forhold til lignende eksperimentelle evolution tidsskalaer som med større volumen kemostater.
Kemostat dyrkning i ministats, som med enhver kemostat, kræver opmærksomhed for detaljer og fejlfinding. Da forureningen er af stor bekymring i kontinuerlig kultur eksperimenter, vi typisk ser via mikroskop for bakteriel og svampeangreb ved podning og hver 50 generationer under langsigtede udvikling eksperimenter. Til dato har vi ikke observeret forurening på tværs af 96 evolution eksperimenter på mere end 300 generationer (data ikke vist). For at teste for krydskontaminering mellem ministats og potentialet for mikrober at kolonisere dyrkningskammeret via afgangsledningen vi løb 16 ministats sådan at hver anden ministat blev podet med gær som ovenfor, og resten blev ikke inokuleret med en kultur. Kulturerne blev opsamles i en fælles affaldsbeholder, som blev tømt hver anden dag. Så hvis det var muligt for forurenende stoffer at komme ind gennem den udstrømmende linje, vi sandsynligvis ville have observeret, at i dette experiment. I løbet af tre uger og mere end 100 generationer af vækst i dette skakbrætmønster af podede og ikke-podede kulturer vi ikke observerer vækst i ikke-inokulerede ministat dyrkningsrør, hvilket tyder på, at forurening udefra gær eller andre mikroorganismer er usandsynlig i eksperimenter lignende tidsrammer.
Selvom ministats var designet til at fungere på en måde analog med kommercielle kemostater, den modulære beskaffenhed af dette arrangement giver mulighed for optimering til at passe brugernes behov og budget. Den peristaltiske pumpe, der anvendes i denne protokol kan opnå strømningshastigheder mellem 0,0186 vol / time til 3,6 vol / t. (data ikke vist). Øget kontrol med fortynding satser kunne opnås med alternative pumpemodeller. Bemærk, at drift ved lavere fortynding rater kan kræve substitution af en højere gauge nål for at opnå den samme frekvens af små dråber levering. Befolkningens størrelse er en vigtig overvejelse for korrekt udformning af evolution eksperimenter.Den normale fortyndingsforhold og næringsstofkoncentrationen anvendes her tilvejebringer en relativ stor population størrelse (~ 10 9 celler) af samme størrelsesorden som offentliggjorte evolution undersøgelser. 11 større eller mindre populationer kunne opretholdes ved at ændre arbejdsvolumen eller begrænsende næringsstof koncentration. Øget mutation forsyning kunne også opnås ved at arbejde med stammer med forhøjede mutationsrater.
De ministats kunne også forbedres i løbet af vores nuværende design. For eksempel kondensation kan samle sig på kultur rørvæggene og kan reduceres betydeligt ved at anvende en dyb vandbad, inkubator eller konstant temperatur. Selv klumpning og væg vækst i sulfat begrænsede kulturer synes at være forholdsvis sjældne, optræder i 5/48 evolution eksperimenter med 300 generationer (data ikke vist), en række overfladeaktive midler er tilgængelige, der kan hjælpe til faldende eller forsinke dette træk. I tilfælde af at sammenklumpning interfererer med passende kulturblanding, forøget omrøring kan opnås ved at reducere antallet af måder hver luftpumpen er opdelt, eller ved tilsætning af et omrøringsapparat. Yderligere prober for opløst gas koncentration, pH eller andre parametre kan også medtages, som i nogle andre designs. 17
Trods de potentielle ændringer, under anvendelse af de ministats som beskrevet i denne protokol vi observeret meget konsekvente eksperimentelle parametre og reproducerbare resultater, når man sammenligner vores enhed til indberettede data for større volumen kommercielle kemostater. Dette omfattede reproducerbarhed af cellulær fysiologi set gennem nå steady-state ligevægt inden for 10-15 generationer (figur 2A) og opnåelse af tilsvarende kultur densiteter ved ligevægt. Genekspressionsmønstre var konsekvente i alle tre biologiske replikerer i ministats og mellem ministats og kommercielle stor volumen platforme (figur 2B), med undtagelse af jern-metabolisme gener. Disse expression forskelle sandsynligvis forårsaget af ændringer i metalindhold af de to enheder eller forbedringer i kvaliteten af medierne ingredienser. Vore data antyder, at ministats vil være nyttig for fysiologi eller konkurrence eksperimenter, hvor et ensartet miljø er påkrævet.
For at teste om ministat design er tilstrækkelig til eksperimentelle evolution ansøgninger, vi udviklede kulturer under sulfat begrænsning for 250 generationer og brugte CGH at karakterisere forstærkning på SUL1 locus -. Kendetegnende for langsigtet udvikling under disse betingelser i større volumen kemostater 10 Vi observerede amplifikation af SUL1 i kloner fra 4/4 uafhængige evolution eksperimenter i sulfat-begrænset medium (figur 2C). Taget som helhed disse data, at ministats er en robust platform, som kan være anvendelige til en række traditionelle kemostat applikationer. Selvom vi demonstreret deres anvendelse i dyrkning spirende gær, de ministats børogså være forenelige med andre organismer og lignende designs er i virkeligheden blevet brugt til dyrkning af bakterier og andre gær arter. 16,17,25 Endvidere mindre kultur volumen og korreleret nedsat behov for medier kan gøre ministats et attraktivt alternativ for eksperimenter, der kræver dyrt eller eksotiske reagenser som kan være tilfældet i kemiske eller genetiske skærme.
The authors have nothing to disclose.
Oprettelse af videoen blev støttet af tilskud fra National Center for Forskning Ressourcer (5P41RR011823-17) og National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) fra National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af NSF tilskud 1.120.425. MJD er en Rita Allen Foundation Scholar. AWM er delvist understøttet af NIH T32 HG00035. Vi takker Anna Sunshine for at få hjælp med at forbedre protokoller. Derudover anerkender vi Sara DiRienzi, Celia Payen, og Amy Sirr som tidlige brugere af ministats.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |