Nous avons développé et validé un ensemble de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces facilement disponibles pour un faible coût. Évolution résulte physiologiques et expérimentales sont similaires à chemostats plus grand volume. Le tableau ministat fournit une plate-forme compacte, peu coûteux et accessible pour les expériences en chémostat traditionnels, la génomique fonctionnelle et les applications de criblage chimique.
Chemostats sont des systèmes de culture continue dans laquelle les cellules sont cultivées dans un très contrôlé, environnement chimiquement stable où la densité de la culture est limitée par la limitation des nutriments spécifiques. 1,2 Les données de chemostats sont hautement reproductible pour la mesure des phénotypes quantitatifs car ils fournissent un taux de croissance constant et de l'environnement à l'état stationnaire. Pour ces raisons, chemostats sont devenus des outils utiles pour la caractérisation à échelle fine de la physiologie à travers l'analyse de l'expression génique 3-6 et d'autres caractéristiques des cultures à l'état stationnaire d'équilibre. 7 à long terme des expériences dans chemostats peut mettre en évidence des trajectoires spécifiques que les populations microbiennes adopter cours de l'évolution adaptative dans un environnement contrôlé. En fait, chemostats ont été utilisées pour l'évolution expérimentale depuis leur invention. 8 Un résultat commun des expériences évolution est pour chaque réplicat biologique d'acquérir un répertoire unique de mutations. 13.9 Cette diversité suggère que il reste encore beaucoup à découvrir en effectuant des expériences évolution avec un débit beaucoup plus important.
Nous présentons ici la conception et l'exploitation d'une relativement simple, array faible coût de chemostats-ou-miniatures Ministats et de valider leur utilisation dans la détermination de la physiologie et de l'évolution dans les expériences avec de la levure. Cette approche implique une croissance des dizaines de chemostats fonctionner sur un seul multiplex pompe péristaltique. Les cultures sont maintenues à un volume de 20 ml de travail, ce qui est pratique pour une variété d'applications. C'est notre espoir que d'augmenter le débit, la diminution des dépenses, et de fournir bâtiment et des instructions détaillées de fonctionnement peuvent également motiver les applications de recherche et industriel de cette conception comme une plate-forme générale pour la caractérisation fonctionnelle grand nombre de souches, les espèces et les paramètres de croissance, ainsi que génétique bibliothèques de drogue ou.
La dynamique de la croissance microbienne et l'évolution sont essentiels à la microbiologie, l'écologie, la génétique et la biotechnologie. La méthode la plus commune de microbes culture est en mode batch, où les cellules sont ensemencées à faible densité en éléments nutritifs riches en bouillon et cultivées jusqu'à saturation. Bien que simple à réaliser en utilisant du matériel de laboratoire standard, des cultures en lots l'expérience d'un environnement chimique fluctuante et modification correspondante de la physiologie cellulaire. Cet environnement de croissance hétérogène peut entraîner des effets sur la croissance et le stress secondaires qui peuvent masquer des différences subtiles physiologiques. Évolution expérimentale par transfert par lots de série permet de sélectionner des mélanges complexes de croissance en phase sous-populations spécifiques, ce qui complique les tentatives de connexion des adaptations à des conditions sélectives. Mesure des phénotypes quantitatifs peut être difficile à cause du bruit de synchronisation des échantillons imprécis et variation des caractéristiques telles que le temps de latence. Cultures continues de fournir une alternativerégime de croissance, où les cellules peuvent être cultivées de façon reproductible dans un milieu chimiquement homogène à une vitesse de croissance définies pour atteindre un état physiologique régulier. En raison de ces avantages, les études d'évolution expérimentale et la caractérisation de l'état cellulaire utilisent souvent l'environnement contrôlé des cultures en continu comme le chemostat 14.
L'appréciation de ces avantages a conduit à un regain d'intérêt pour les cultures en chémostat 15. Depuis leur introduction en 1950, 1,2 en chémostat systèmes ont été développés pour fonctionner sur une variété d'échelles allant de litres d'microlitres et pour une variété d'applications 16. -19 Ces différents modèles, qui vont de bioréacteurs produits dans le commerce pour les navires à glassblown personnalisés plateformes microfluidiques, la part de principes généraux de conception. Enceinte de culture est agitée et aérée (en général en faisant barboter de l'air à travers celui-ci) et les microbes contenus dans celui-ci sont maintenus homogènely dispersées dans toute la chambre de culture à tout moment. Composition de milieu frais est ajouté continuellement définie et la vitesse d'addition contrôle le taux de croissance et influence de l'environnement chimique connu par la culture. Un débordement définit le volume de la culture dans le tube de la croissance, et à travers ce débordement de la culture seront échantillonnés à la même vitesse à laquelle pénètre un milieu frais. De cette manière, les cultures d'atteindre rapidement un état physiologique stable au cours de laquelle de nombreux paramètres biologiques restent constants. Malgré les avantages de chemostats et les rapports de ces différentes plates-formes dans la littérature, l'adoption généralisée a été limitée par des difficultés dans la construction et l'exploitation de ces systèmes et les coûts élevés liés aux options commerciales. En outre descriptions sur la façon de faire et d'utiliser ces appareils peut être opaque.
Nous présentons des dessins et des instructions pour l'utilisation d'un tableau de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces disponibles facilement à faible coût. Nous observez très uniformes paramètres expérimentaux et des résultats reproductibles lorsque l'on compare notre dispositif aux données déclarées pour les levures cultivées dans des bioréacteurs de grands volumes commerciaux. Cela inclut la reproductibilité de la physiologie cellulaire comme on le voit à travers atteint l'état d'équilibre équilibre en 10-15 générations et d'obtenir des densités de culture similaires à l'équilibre. En outre, les profils d'expression géniques sont compatibles entre Ministats et un plus grand volume commercial de la plateforme. Stabilité du taux de dilution, la densité optique et la reproductibilité de l'expression des gènes entre les trois cultures répétées démontrer la robustesse de notre plate-forme. Nous montrons également que les mêmes mutations adaptatives se posent sur l'évolution des délais similaires expérimentales avec chemostats plus grand volume.
Culture chemostat dans les Ministats, comme avec n'importe quel chémostat, exige de la minutie et le dépannage. Depuis la contamination est très préoccupante dans les expériences de culture continue, nous recherchent généralement via microscope pour la contamination bactérienne et fongique après inoculation et tous les 50 générations lors des expériences évolution à long terme. À ce jour, nous n'avons pas observé de contamination dans 96 expériences évolution de plus de 300 générations (données non présentées). Pour tester la contamination croisée entre les Ministats et le potentiel pour les microbes de coloniser la chambre de culture par le biais de la ligne d'effluent nous avons couru 16 Ministats telles que chaque ministat autre a été inoculé avec de la levure comme ci-dessus et le reste n'ont pas été inoculés avec une culture. Les cultures ont été prélevés dans un conteneur à déchets communaux, qui a été vidé tous les deux jours. Ainsi, s'il était possible pour les contaminants de pénétrer à travers la ligne d'effluent que nous aurions probablement observé que dans cette expériment. Pendant trois semaines et plus de 100 générations de la croissance de ce motif en damier de cultures inoculées et non inoculées, nous n'avons pas observé la croissance non inoculés tubes de culture MINISTAT, ce qui suggère que la contamination de la levure à l'extérieur ou d'autres microbes est peu probable de se produire dans des expériences de des délais similaires.
Bien que les Ministats ont été conçus pour fonctionner dans un mode analogue à chemostats commerciaux, la nature modulaire de cet arrangement permet une optimisation en fonction des besoins des utilisateurs et du budget. La pompe péristaltique utilisée dans le présent protocole peut atteindre des débits compris entre 0,0186 vol / h à 3,6 vol / h (données non présentées). Un contrôle accru des taux de dilution peut être réalisée avec les modèles de pompe de rechange. Noter que le fonctionnement à taux de dilution inférieur peut exiger la substitution d'une aiguille de calibre supérieur pour obtenir la même fréquence de réception de gouttelettes. Taille de la population est un facteur important pour une bonne conception des expériences d'évolution.Le taux de dilution standard et la concentration nutritive utilisée ici fournit une taille de population relativement importante (~ 10 9 cellules) du même ordre de grandeur que les études publiées évolution. 11 populations plus petites ou plus pourrait être maintenue en changeant le volume de travail ou de limiter la concentration en nutriments. Alimentation mutation accrue pourrait également être obtenus en travaillant avec des souches avec des taux de mutation élevés.
Les Ministats pourrait également être améliorée au cours de notre conception actuelle. Pour la condensation par exemple peuvent se déposer sur les parois des tubes de culture et peut être considérablement réduite en utilisant une profonde bain-marie, un incubateur ou une chambre à température constante. Bien que l'agglutination et la croissance mur de sulfate de cultures limitées semble être relativement rare, apparaissant dans des expériences évolution 5/48 par 300 générations (données non présentées), une variété de tensioactifs sont disponibles qui peuvent aider à diminuer ou retarder cette caractéristique. Dans le cas où agglutination interfère avec la culture adéquatle mélange, sous agitation accrue peut être obtenue en réduisant le nombre de voies de chaque pompe à air est divisée, ou en ajoutant un dispositif d'agitation. Sondes supplémentaires pour la concentration en gaz dissous, le pH ou d'autres paramètres peuvent également être inclus, comme dans quelques autres conceptions 17.
Malgré les modifications possibles, en utilisant les Ministats telles que décrites dans ce protocole, nous avons observé très uniformes paramètres expérimentaux et des résultats reproductibles lorsque l'on compare notre dispositif aux données déclarées pour chemostats grand volume commerciales. Cela comprenait la reproductibilité de la physiologie cellulaire comme on le voit par atteindre l'état stationnaire d'équilibre dans les 10-15 générations (figure 2A) et d'obtenir des densités de culture similaires à l'équilibre. Profils d'expression génique sont compatibles entre trois biologique réplique dans Ministats et entre Ministats et commerciaux à grand volume de plates-formes (figure 2B), à l'exception des gènes du métabolisme du fer. Ces expression différences sont probablement causés par des changements dans la teneur en métaux des deux dispositifs ou d'améliorations dans la qualité des ingrédients médias. Nos données suggèrent que Ministats sera utile pour les expériences de physiologie ou de la compétition où un environnement cohérent est nécessaire.
Pour tester si la conception ministat est suffisante pour des applications expérimentales évolution nous évolué cultures sous limitation de sulfate pour 250 générations et utilisé pour caractériser CGH amplification au niveau du locus sul1 -. Marque distinctive de l'évolution à long terme dans ces conditions dans chemostats grand volume 10 Nous observée amplification de sul1 dans les clones de 04.04 expériences évolution indépendants en sulfate limitées médias (figure 2C). Pris dans leur ensemble, ces données suggèrent que Ministats sont une plate-forme robuste qui peut être utile pour une variété d'applications chémostat traditionnels. Bien que nous ont manifesté leur utilisation dans la culture de levure bourgeonnante, les Ministats devraitégalement être compatible avec d'autres organismes et des conceptions similaires ont en fait été utilisé pour la culture des bactéries et d'autres espèces de levures. 16,17,25 En outre, le plus petit volume de la culture et de corrélation réduction du besoin de médias peuvent apporter Ministats une alternative intéressante pour des expériences nécessitant coûteux ou exotiques réactifs comme cela peut être le cas dans l'industrie chimique ou cribles génétiques.
The authors have nothing to disclose.
Création de la vidéo a été soutenue par des subventions du National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) et l'Institut national des sciences médicales générales (8 P41 GM103533-17) du National Institutes of Health. Ce travail a également été soutenu par la NSF subvention 1120425. MJD est une Fondation Rita Allen Scholar. MN est soutenu en partie par le NIH T32 HG00035. Nous remercions Anna soleil de l'aide pour l'amélioration des protocoles. En outre, nous reconnaissons Sara DiRienzi, Celia Payen, et Amy Sirr que les premiers utilisateurs des Ministats.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |