פתחנו ומאומתים מערך טביעת רגל הקטנה של chemostats מיניאטורי שנבנה מחלקים בקלות רבה זמינים עבור עלות נמוכה. תוצאות התפתחות פיסיולוגיות וניסוייות היו דומות לchemostats נפח הגדול יותר. מערך ministat מספק פלטפורמה קומפקטית, זולה ונגישה לניסויים מסורתיים chemostat, גנומיקה תפקודית, ויישומי הקרנה כימית.
Chemostats הם מערכות תרבות מתמשכות שבו תאים גדלים בסביבת פיקוח הדוקה, כימי קבועה שבו צפיפות התרבות היא מוגבלת על ידי הגבלת מרכיבי מזון מסוימים. 1,2 נתונים מchemostats הם לשעתק ביותר למדידת פנוטיפים כמותיים כמו שהם מספקים שיעור צמיחה מתמדת ואיכות הסביבה במצב יציב. מסיבות אלה, chemostats הפכו כלים שימושיים לאפיון בקנה מידה זעיר של פיזיולוגיה באמצעות ניתוח של ביטוי גנים 3-6 ומאפיינים אחרים של תרבויות באיזון המצב יציב. 7 ניסויים ארוכי הטווח בchemostats יכולים לסמן מסלולים ספציפיים שאוכלוסיות של חיידקים לאמץ במהלך האבולוציה אדפטיבית בסביבה מבוקרת. למעשה, chemostats שמשה במשך אבולוציה ניסיונית מאז המצאתם. 8 תוצאה נפוצה בניסויי אבולוציה היא עבור כל לשכפל ביולוגי לרכוש רפרטואר ייחודי של מוטציות. 9-13 גיוון זה מצביע על כך שלא נותר הרבה כדי שיתגלה על ידי ביצוע ניסויי אבולוציה עם תפוקה גדולה בהרבה.
אנו מציגים כאן העיצוב ותפעול של מערך פשוט יחסית, בעלות נמוך של chemostats או מיניאטוריים ministats-ולאמת את השימוש בם בנחישות לפיזיולוגיה ואבולוציה בניסויים עם שמרים. גישה זו כרוכה בגידול של עשרות chemostats לברוח אחת multiplexed משאבת peristaltic. התרבויות נשמרות בנפח 20 מיליליטר עבודה, שהוא מעשי עבור מגוון רחב של יישומים. תקוותנו היא כי הגדלת תפוקה, להקטין הוצאות, ומתן בניין מפורט והוראות הפעלה יכולה גם להניע את המחקר ויישום תעשייתי של העיצוב הזה כפלטפורמה כללית לאפיון מספר גדול של זנים, מינים ופרמטרי צמיחה פונקציונלית, כמו גם גנטי או ספריות סמים.
הדינמיקה של צמיחה והתפתחות חיידקים הן יסוד למיקרוביולוגיה, אקולוגיה, גנטיקה, וביוטכנולוגיה. השיטה הנפוצה ביותר של חיידקי culturing היא ביצווה, שבו תאים מחוסנים בצפיפות נמוכה לתוך מרק מזין עשיר וגדלו לרוויה. למרות שברור לביצוע תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי, תרבויות יצוו לחוות סביבה כימית משתנית ובמקביל משתנות פיזיולוגיה סלולרית. סביבת גידול הטרוגנית זה יכול לגרום לתופעות גדילה ולחץ משתי שיכול להסוות הבדלים פיסיולוגיים עדינים. אבולוציה ניסויית על ידי העברה יצווה סידורית יכולה לבחור לתערובות מורכבות של אוכלוסיות ספציפיות צמיחה-שלב, מסבכת את הניסיונות להתאמות לתנאים סלקטיבית ספציפיים. מדידה של פנוטיפים כמותיים יכולה להיות קשה בשל רעש מעיתוי מדויק לדוגמה וגיוון בתכונות כגון זמן השהיה. תרבויות רציפות לספק חלופהמשטר שבו תאי גידול יכול להיות מתורבת reproducibly בסביבה כימית הומוגנית בקצב צמיחה מוגדרת כדי להגיע למצב יציב פיסיולוגי. בגלל היתרונות הללו, מחקרים של אבולוציה ואפיון ניסיוני של מדינה סלולרית לעתים קרובות לנצל את הסביבה המבוקרת של תרבויות רציפות כמו chemostat 14.
הערכה של יתרונות אלה הביאה להתעוררות מחודשת בעניין בתרבויות chemostat 15. מאז ההיכרות שלהם בשנת 1950, 1,2 מערכות chemostat פותחו לתפקד במגוון של קשקשים הנעים בין ליטר לmicroliters ועבור מגוון רחב של יישומים. 16 -19 עיצובים אלו שונים, אשר נעו בין bioreactors מיוצר באופן מסחרי לכלי glassblown לפלטפורמות מותאמות אישית מיקרופלואידיקה, עקרונות עיצוב כלליים מניות. קאמרי תרבות עורר ואוורר (בדרך כלל על ידי מבעבע האוויר דרכו) ואת החיידקים הכלולים בו נשמרים הומוגניתly התפזר בכל רחבי חדר התרבות בכל העת. מדיום חדש של הרכב מוגדר הוסיף רף והשיעור בנוסף שולט ומשפיע על קצב צמיחה לסביבה הכימית שחוותה את התרבות. הצפה מגדירה את נפח התרבות בצינור הצמיחה, ובאמצעות גלישה זה התרבות תהיה תדגם באותו הקצב שבו מדיום טרי נכנס. בדרך זו תרבויות להגיע למצב יציב פיסיולוגי שבו פרמטרים רבים ביולוגיים יישארו קבועים במהירות. למרות היתרונות של chemostats ודיווחים של פלטפורמות השונות אלה בספרות, אימוץ נרחב היה מוגבל על ידי קשיים בבנייה והפעלה של מערכות אלו, ועלויות גבוהות הקשורות עם אפשרויות מסחריות. יתר על כן תיאורים של איך לעשות ולהשתמש במכשירים אלה יכולים להיות אטומים.
אנו מציגים עיצובים והנחיות לשימוש במערך טביעת רגל הקטנה של chemostats מיניאטורי שנבנה מחלקים הזמינים בקלות רבה בעלות נמוכה. אנו בדיקות מסerve פרמטרים ניסיוניים עקביים מאוד ותוצאות לשעתק כאשר משווים המכשיר שלנו לנתונים שדווחו לשמרים בתרבית בbioreactors המסחרי בנפח הגדול יותר. זה כולל שחזור של פיזיולוגיה תאית כמו לראות דרך להגיע לאיזון מצב יציב בתוך 10-15 דורות וקבלת צפיפויות תרבות דומות בשיווי משקל. בנוסף, דפוסי ביטוי גנים הם עקביים בין ministats ופלטפורמה מסחרית בנפח גדול יותר. יציבות של שיעור דילול, צפיפות אופטית ושחזור של ביטוי גנים בין שלוש תרבויות לשכפל להפגין את החוסן של הפלטפורמה שלנו. אנו גם מראים כי מוטציות מסתגלות אותם עולות על לוחות זמני אבולוציה ניסיוניים דומים כמו עם chemostats נפח גדול יותר.
טיפוח Chemostat בministats, כמו בכל chemostat, דורש תשומת לב לפרטים ובעיות ירי. מאז הזיהום הוא המקור לדאגה רבה בניסויי התרבות רציפים, אנחנו בדרך כלל מסתכלים דרך מיקרוסקופ לזיהום חיידקים ופטריות על חיסון וכל 50 דורות במהלך ניסויי אבולוציה לטווח הארוך. נכון להיום יש לנו לא נצפה זיהום על פני 96 ניסויי אבולוציה של יותר מ 300 דורות (מידע לא מוצג). לבדיקת זיהום צולב בין ministats והפוטנציאל לחיידקים להתנחל קאמרי התרבות בדרך של קו השפכים רצנו 16 ministats כאלה שכל ministat האחר היה מחוסן עם שמרים כאמורים לעיל והשאר לא מחוסן בכל תרבות. תרבויות נדגמו לתוך מכולת אשפה קהילתית, שהתרוקנה בכל יום אחר. לכן, אם זה היה אפשרי למזהמים להיכנס דרך קו השפכים שסבירים היה שנצפה בexperim זהאף אוזן גרון. במהלך שלושה שבועות ויותר מ 100 דורות של צמיחה בדפוס שחמט זה של תרבויות מחוסנות ולא מחוסנים, לא חגג את הצמיחה בצינורות שאינם מחוסנים-ministat תרבות, טוען כי זיהום שמרים או חיידקים אחרים מחוץ הוא שלא להתרחש בניסויים של מסגרות זמן דומים.
למרות ministats תוכננו לפעול בצורה דומה לchemostats המסחרי, האופי המודולרי של הסדר זה מאפשר לאופטימיזציה שיתאים לצרכימים ולתקציב של המשתמשים. משאבת peristaltic שימוש בפרוטוקול זה יכול להשיג ספיקות בין 0.0186 כרך / שעה ל -3.6 כרך / שעה (מידע לא מוצג). שליטה מוגברת של שיעורי דילול יכולה להתבצע עם משאבת מודלים חלופיים. שים לב שפעולה בשיעורי דילול נמוכים עשויה לדרוש החלפה של מחט מד גבוה יותר כדי להשיג את אותה התדירות של משלוח טיפה. גודל אוכלוסייה הוא שיקול חשוב לעיצוב נכון של ניסויי אבולוציה.התעריף הסטנדרטי הדילול וריכוז חומר מזין שמספקים כאן גודל אוכלוסייה גדול יחסית (~ 10 9 תאים) באותו סדר הגודל כמו לימודי אבולוציה שפורסם. גדולות או קטנות יותר אוכלוסיות 11 יכולות להישמר על ידי שינוי נפח העבודה או הגבלת ריכוז חומר מזין. אספקת מוטציה מוגברת גם יכולה להיות מושגת על ידי עבודה עם זנים בעלי שיעורי מוטציה גבוהות.
את ministats גם יכול להיות שיפור על העיצוב הנוכחי שלנו. לעיבוי למשל יכול לאסוף על קירות צינור התרבות ויכול להיות מופחת באופן משמעותי על ידי שימוש waterbath עמוק, חממה, או חדר טמפרטורה קבועה. למרות clumping וצמיחת קיר בתרבויות המוגבלות סולפט נראית נדיר יחסית, המופיעה ב5/48 ניסויי אבולוציה על 300 דורות (מידע לא מוצג), מגוון של חומרים פעילים שטח זמין שעשוי לסייע בהפחתה או לעכב תכונה זו. במקרה שclumping מפריע לתרבות הנאותהתסיסת ערבוב, מוגברת יכולה להיות מושגת על ידי צמצום מספר הדרכים כל משאבת אוויר מחולקת, או על ידי הוספת מנגנון ערבוב. בדיקות נוספות לריכוז מומס גז, pH, או פרמטרים אחרים יכולות להיות גם כלל, כמו בכמה דגמים אחרים 17.
למרות שינויים פוטנציאליים, תוך שימוש בministats כמתואר בפרוטוקול זה, אנו נצפינו פרמטרים ניסיוניים עקביים מאוד ותוצאות לשעתק כאשר משווים המכשיר שלנו לנתונים שדווח לchemostats המסחרי בנפח גדול יותר. זו כללה שחזור של פיזיולוגיה תאית כמו לראות דרך להגיע לאיזון מצב יציב בתוך 10-15 דורות (איור 2 א) וקבלת צפיפויות תרבות דומות בשיווי משקל. דפוסי ביטוי גנים היו עקביים לאורך 3 ביולוגיים משכפלים בministats ובין ministats ופלטפורמות מסחר בנפח גדול (איור 2 ב '), למעט בגנים של חילוף חומרים של ברזל. אלה expהבדלי ression נגרמים ככל הנראה על ידי שינויים בתכולת מתכות של שני המכשירים או השיפורים באיכות מרכיבי תקשורת. הנתונים שלנו מראים שministats יהיה שימושי עבור ניסויי פיזיולוגיה או תחרות בי סביבה עקבית נדרשת.
כדי לבדוק אם עיצוב ministat מספיק עבור יישומים ניסיוניים אבולוציה התפתחנו תרבויות תחת מגבלת סולפט במשך 250 דורות ושמשנו CGH לאפיין הגברה במוקד SUL1 -. היכר של אבולוציה לטווח הארוך בתנאים אלה בנפח הגדול יותר chemostats 10 אנחנו נצפינו הגברה של SUL1 בשיבוטים מ4 / 4 ניסויי אבולוציה עצמאיים בתקשורת סולפט-מוגבלת (האיור 2C). צילום בכללות נתונים אלה מראים כי ministats הם פלטפורמה יציבה שעשויה להיות שימושיים עבור מגוון רחב של יישומי chemostat מסורתיים. למרות שאנחנו הוכחנו את השימוש בם בשמרי ניצני culturing, את צריך ministatsגם בקנה אחד עם אורגניזמים אחרים ועיצובים דומים שלמעשה שמשו במשך חיידקי culturing ומיני שמרים אחרים. 16,17,25 יתר הנפח הקטן יותר התרבות וצורך ירידה בקורלציה לתקשורת עשויות להפוך ministats חלופה אטרקטיבית לניסויים הדורשים יקר או אקזוטי ריאגנטים כיכולים להיות המקרה במסכים כימיים או גנטיים.
The authors have nothing to disclose.
יצירת הווידאו נתמכת על ידי מענקים מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר (5P41RR011823-17) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (8 P41 GM103533-17) מהמכונים הלאומיים לבריאות. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק NSF 1120425. MJD הוא ריטה אלן קרן Scholar. AWM נתמך בחלקו על ידי NIH T32 HG00035. אנו מודים סאנשיין אנה לסיוע בשיפור פרוטוקולים. בנוסף, אנו מכירים בכך שרה DiRienzi, סיליה Payen, ואיים אדונים? כמשתמשים ראשונים של ministats.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |