Vi utviklet og validert en liten plassbruk rekke miniatyr chemostats bygget fra lett tilgjengelige deler til lav pris. Fysiologiske og eksperimentell evolusjon resultatene var lik større volum chemostats. Den ministat rekke gir en kompakt, billig og tilgjengelig plattform for tradisjonelle chemostat eksperimenter, funksjonell genomikk og kjemiske screening programmer.
Chemostats er kontinuerlig kultur i hvilke celler dyrket i et strengt kontrollert, kjemisk stabile omgivelser der kultur tetthet er begrenset av å begrense spesifikke næringsstoffer. 1,2 Data fra chemostats er svært reproduserbare for måling av kvantitative fenotyper som de gir en konstant vekstrate og miljø ved steady state. Av disse grunner, har chemostats blitt nyttige verktøy for fine skala karakterisering av fysiologi gjennom analyse av genuttrykk 3-6 og andre kjennetegn kulturer ved steady-state likevekt. 7 Langsiktige eksperimenter i chemostats kan markere bestemte baner som mikrobielle populasjoner vedta under adaptive evolusjon i et kontrollert miljø. Faktisk har chemostats blitt brukt for eksperimentell utvikling siden oppfinnelsen sin. 8 En vanlig resultat i evolusjon eksperimenter er for hver biologisk replikere å få en unik repertoar av mutasjoner. 9-13 Dette mangfoldet tyder på at det er mye igjen å bli oppdaget ved å utføre evolusjon eksperimenter med langt større gjennomstrømming.
Vi presenterer her utforming og drift av en relativt enkel, rimelig utvalg av miniatyr chemostats-eller ministats-og validere deres bruk i fastsettelse av fysiologi og i evolusjon eksperimenter med gjær. Denne tilnærmingen innebærer vekst av titalls chemostats kjøre av en enkelt multiplekset peristaltisk pumpe. Kulturene holdes ved en 20 ml arbeidsvolum, som er praktisk for en rekke anvendelser. Det er vår håp at økende gjennomstrømning, minkende regning, og gi detaljert bygning og drift instruksjoner kan også motivere forskning og industriell anvendelse av dette motivet som en generell plattform for funksjonelt karakteriserer stort antall bakteriestammer, arter, samt vekstparametre, samt genetisk eller narkotika bibliotekene.
Dynamikken i mikrobiell vekst og utvikling er grunnleggende for mikrobiologi, økologi, genetikk og bioteknologi. Den vanligste metoden for dyrking mikrober er i batch, hvor cellene blir vaksinert ved lav tetthet i næringsrikt buljong og vokst til metning. Selv enkle å utføre ved hjelp av standard laboratorieutstyr, batch kulturer oppleve en varierende kjemisk miljø og tilsvarende endring mobilnettet fysiologi. Denne heterogene vekst miljøet kan føre til sekundære vekst og stress effekter som kan maskere subtile fysiologiske forskjeller. Eksperimentell evolusjon ved seriell batch overføring kan velge for komplekse blandinger av vekst-fase spesifikke subpopulasjoner, kompliserende forsøk på å koble tilpasninger til bestemte selektive forhold. Måling av kvantitative fenotyper kan være vanskelig på grunn av støy fra upresis prøve timing og variasjon i funksjoner som lag tid. Sammenhengende kultur gi et alternativvekst regime hvor celler kan reproduserbart dyrkes i en kjemisk homogen miljø på en definert vekstrate å nå en fysiologisk steady state. På grunn av disse fordelene, studier av eksperimentell evolusjon og karakterisering av cellulær tilstand ofte utnytte kontrollert miljø av kontinuerlige kulturer som chemostat. 14
Styrking av disse fordelene har ført til en oppblomstring i interessen for chemostat kulturer. 15 Siden de ble introdusert i 1950, har 1,2 chemostat systemer er utviklet for å fungere på en rekke skalaer fra liter til mikroliter og for en rekke bruksområder. 16 -19 Disse ulike design, som spenner fra kommersielt produsert bioreaktorer til glassblown fartøy til egendefinerte MicroFluidics plattformer, dele generelle design prinsipper. En kultur kammer omrøres og luftes (vanligvis ved bobling luft gjennom det) og mikrobene deri holdes homogenly dispergert i hele kulturen kammeret til enhver tid. Friskt medium av definert sammensetning tilsettes kontinuerlig og tilsetningshastigheten kontrollerer vekstraten og påvirker kjemiske miljøet oppleves av kulturen. Et overløp setter kulturen volum i veksten røret, og gjennom dette overløp kulturen blir samplet på samme hastighet ved hvilken friskt medium trer. På denne måten kulturer raskt nå en fysiologisk steady state der mange biologiske parametre holdes konstante. Til tross for fordelene med chemostats og rapporter fra de ulike plattformene i litteraturen, har utbredelsen vært begrenset av vanskeligheter i bygging og drift disse systemene, og høye kostnader forbundet med kommersielle alternativer. Videre beskrivelser av hvordan å lage og bruke disse enhetene kan være ugjennomsiktig.
Vi presenterer design og instruksjoner for bruk av en liten plassbruk rekke miniatyr chemostats bygget fra lett tilgjengelige deler til en lav kostnad. Vi obsErve svært konsekvente eksperimentelle parametre og reproduserbare resultater når man sammenligner vår enhet til innrapporterte data for gjær dyrket i større volum kommersielle bioreaktorer. Dette inkluderer reproduserbarhet av mobilnettet fysiologi sett gjennom steady-state likevekt innen 10-15 generasjoner og skaffe tilsvarende kultur tettheter ved likevekt. I tillegg genuttrykksmønster er konsistente mellom ministats og en kommersiell større volum plattform. Stabilitet av fortynning rate, optisk tetthet og reproduserbarhet av genuttrykk mellom tre gjentatte kulturer demonstrere robustheten vår plattform. Vi viser også at de samme adaptive mutasjoner oppstår over lignende eksperimentelle evolusjon tidsskalaer som med større volum chemostats.
Chemostat dyrking i ministats, som med alle chemostat, krever oppmerksomhet på detaljer og feilsøking. Siden forurensning er av stor bekymring i kontinuerlig kultur eksperimenter, vi vanligvis ser via mikroskop for bakterier og sopp forurensning ved inokulering og hver 50 generasjoner under langsiktige utviklingen eksperimenter. Hittil har vi ikke observert forurensning over 96 evolusjon eksperimenter på mer enn 300 generasjoner (data ikke vist). For å teste for krysskontaminering mellom ministats og potensialet for mikrober å kolonisere kultur kammeret ved hjelp av avløpet linje vi kjørte 16 ministats slik at annenhver ministat ble inokulert med gjær som ovenfor og resten ble ikke inokulert med enhver kultur. Kulturene ble samplet i en felles avfallsbeholder, som ble tømt annenhver dag. Dermed hvis det var mulig for forurensninger å gå inn gjennom avløpet linjen vi sannsynligvis ville ha observert at i denne experiment. I løpet av tre uker og større enn 100 generasjoner av veksten i denne rutemønster av inokulerte og ikke-inokulert kulturer vi ikke observere vekst i ikke-inokulert ministat kultur rør, noe som tyder på at forurensning utenfra gjær eller andre mikrober er lite sannsynlig i eksperimenter av lignende tidsrammer.
Selv om ministats ble designet for å operere på en måte analogt til kommersielle chemostats, gjør den modulære natur av denne ordningen for optimalisering å passe brukernes behov og budsjett. Den peristaltiske pumpe som brukes i denne protokollen kan oppnå strømningshastigheter mellom 0,0186 vol / time til 3,6 vol / time (data ikke vist). Økt kontroll av fortynning priser kan oppnås med alternative pumpemodeller. Merk at drift ved lavere fortynning priser kan kreve substitusjon av en høyere gauge nål for å oppnå den samme frekvensen av dråpene produksjonstid. Bestandsstørrelse er en viktig faktor for riktig design av evolusjon eksperimenter.Standarden fortynningshastigheten og næringsstoffer konsentrasjon brukt her gir en relativt stor befolkning størrelse (~ 10 9 celler) av samme størrelsesorden som publiserte evolusjon studier. 11 større eller mindre populasjoner kunne opprettholdes ved å endre arbeidsvolum eller begrensende næringsstoff konsentrasjon. Økt mutasjon leveranser kan også oppnås ved å arbeide med stammer med forhøyede mutasjon priser.
De ministats kan også bli bedre over vår nåværende design. For eksempel kondens kan avleires på kultur rørveggene og kan bli sterkt redusert ved hjelp av en dyp vannbad, inkubator eller konstant temperatur rom. Selv clumping og vegg vekst i sulfat begrensede kulturer ser ut til å være relativt sjeldne, som vises i 5/48 evolusjon eksperimenter med 300 generasjoner (data ikke vist), et utvalg av tensider er tilgjengelig som kan hjelpe i å redusere eller forsinke denne egenskapen. I tilfelle at klumpdannelse forstyrrer tilstrekkelig kulturblanding, økt agitasjon kan oppnås ved å redusere antall av måter hver luftpumpe deles, eller ved å legge en omrøring apparat. Ytterligere prober for oppløst gass konsentrasjon, pH, eller andre parametere kan også være inkludert, som i noen andre motiver. 17
Til tross for potensielle endringer, ved hjelp av ministats som beskrevet i denne protokollen, observerte vi svært konsekvente eksperimentelle parametre og reproduserbare resultater når man sammenligner vår enhet til innrapporterte data for større volum kommersielle chemostats. Dette inkluderte reproduserbarhet av mobilnettet fysiologi sett gjennom steady-state likevekt innen 10-15 generasjoner (figur 2A) og skaffe tilsvarende kultur tettheter ved likevekt. Genuttrykksmønster var konsistente på tvers av tre biologiske replikerer i ministats og mellom ministats og kommersielle store volum plattformer (figur 2B), med unntak av jern metabolisme gener. Disse expression forskjeller er sannsynligvis forårsaket av endringer i metall innhold av de to enhetene eller forbedringer i kvaliteten på media ingredienser. Våre data tyder på at ministats vil være nyttig for fysiologi eller konkurranse eksperimenter der en konsekvent miljø er nødvendig.
For å teste om ministat design er tilstrekkelig for eksperimentelle evolusjon applikasjoner vi utviklet kulturer henhold sulfat begrensning for 250 generasjoner og brukte CGH å karakterisere forsterkning på SUL1 locus -. Et kjennetegn på langsiktige utviklingen under disse forholdene i større volum chemostats 10 Vi observerte forsterkning av SUL1 i kloner fra 4/4 uavhengige evolusjon eksperimenter i sulfat-begrensede media (figur 2C). Sett under ett antyder disse dataene at ministats er en robust plattform som kan være nyttig for en rekke tradisjonelle chemostat applikasjoner. Selv om vi demonstrert bruken i dyrking spirende gjær, de ministats børogså kompatibel med andre organismer og lignende design har faktisk blitt brukt til dyrking bakterier og andre gjær arter. 16,17,25 Videre mindre kultur volum og korrelert redusert behov for media kan gjøre ministats et attraktivt alternativ for eksperimenter som krever dyrt eller eksotisk reagenser som kan være tilfelle i kjemiske eller genetiske skjermer.
The authors have nothing to disclose.
Etableringen av videoen ble støttet med tilskudd fra National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) og National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) fra National Institutes of Health. Dette arbeidet ble også støttet av NSF tilskudd 1.120.425. MJD er en Rita Allen Foundation Scholar. AWM støttes delvis av NIH T32 HG00035. Vi takker Anna Sunshine for å få hjelp med å forbedre protokoller. I tillegg erkjenner vi Sara DiRienzi, Celia Payen, og Amy Sirr som tidlige brukere av ministats.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |