Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.
Quimiostatos son sistemas de cultivo continuo en el que las células se cultivan en un muy controlado, ambiente químicamente constante donde está limitada la densidad de cultivo mediante la limitación de nutrientes específicos. 1,2 Datos de quimiostatos son altamente reproducibles para la medición de caracteres cuantitativos, ya que proporcionan una tasa de crecimiento constante y el medio ambiente en estado estacionario. Por estas razones, quimiostatos se han convertido en herramientas útiles para la caracterización a escala fina de la fisiología a través del análisis de la expresión génica 3-6 y otras características de los cultivos en equilibrio de estado estacionario. 7 experimentos a largo plazo en quimiostatos puede resaltar trayectorias específicas que las poblaciones microbianas adopten durante la evolución adaptativa en un entorno controlado. De hecho, quimiostatos se han utilizado para la evolución experimental desde su invención. 8 Un resultado común en experimentos de evolución está para cada réplica biológica para adquirir un repertorio único de mutaciones9-13. Esta diversidad indica que aún queda mucho por descubrir mediante la realización de experimentos de evolución con un rendimiento mucho mayor.
Se presenta aquí el diseño y operación de una relativamente simple, de bajo costo de matriz quimiostatos-o miniatura ministats-y validar su uso en la determinación de la fisiología y en experimentos de evolución con levadura. Este enfoque implica el crecimiento de decenas de quimiostatos funcionan con una sola multiplexado bomba peristáltica. Los cultivos se mantienen en un volumen de 20 ml de trabajo, que es práctico para una variedad de aplicaciones. Tenemos la esperanza de que el aumento de rendimiento, disminución de gastos, y la disponibilidad para la construcción detallada e instrucciones de operación también pueden motivar la investigación y la aplicación industrial de este diseño como una plataforma general para caracterizar funcionalmente gran número de cepas, las especies y los parámetros de crecimiento, así como la genética o bibliotecas de medicamentos.
La dinámica del crecimiento microbiano y la evolución son fundamentales para la microbiología, la ecología, la genética y la biotecnología. El método más común de los microbios de cultivo es en lotes, donde las células se inoculan a baja densidad en caldo rico en nutrientes y se cultivaron hasta saturación. Aunque fácil de realizar utilizando un equipo estándar de laboratorio, cultivos discontinuos experimentar un ambiente químico fluctuante y en consecuencia cambiar la fisiología celular. Este entorno de crecimiento heterogéneo puede resultar en efectos secundarios de crecimiento y estrés que pueden enmascarar sutiles diferencias fisiológicas. Evolución experimental mediante transferencia por lotes de serie puede seleccionar para mezclas complejas de subpoblaciones fase de crecimiento específicos, lo que complica los intentos de conexión adaptaciones específicas para condiciones selectivas. Medición de caracteres cuantitativos puede ser difícil debido al ruido de sincronización de la muestra imprecisa y la variación en las características tales como tiempo de retraso. Cultivos continuos proporcionan una alternativarégimen de crecimiento donde las células puede ser reproducible cultivada en un medio químicamente homogénea a una tasa de crecimiento definido para alcanzar un estado de equilibrio fisiológico. Debido a estas ventajas, los estudios de evolución experimental y caracterización del estado celular utilizan a menudo el ambiente controlado de cultivos continuos como el quimiostato. 14
Valoración de estas ventajas ha llevado a un resurgimiento del interés en chemostat culturas. 15 Desde su introducción en 1950, 1,2 chemostat sistemas han sido desarrollados para funcionar en una variedad de escalas que van desde litros a microlitros y para una variedad de aplicaciones. 16 -19 Estos diseños diferentes, que van desde biorreactores producidos comercialmente a los buques glassblown a las plataformas de microfluidos personalizados, comparte los principios generales de diseño. Una cámara de cultivo se agita y se airea (generalmente por burbujeo de aire a través de él) y los microbios contenidos en el mismo se mantiene homogéneaLy dispersado por toda la cámara de cultivo en todo momento. Medio fresco de la composición definida se añade continuamente y la velocidad de adición controla la tasa de crecimiento y la influencia del entorno químico experimentado por el cultivo. Un desbordamiento establece el volumen de cultivo en el tubo de crecimiento, y a través de este desbordamiento de la cultura se muestrea a la misma velocidad a la que entra en medio fresco. De esta manera las culturas alcanzan rápidamente un estado fisiológico estable en el que muchos parámetros biológicos se mantienen constantes. A pesar de las ventajas de quimiostatos e informes de estas plataformas diferentes en la literatura, la adopción generalizada se ha visto limitado por dificultades en la construcción y operación de estos sistemas, y los altos costos asociados con las opciones comerciales. Además las descripciones de cómo realizar y utilizar estos dispositivos pueden ser opacas.
Se presentan diseños e instrucciones de uso de una matriz de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidos a partir de piezas fácilmente disponibles a bajo costo. Nos obsErve parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por levaduras cultivadas en biorreactores de mayor volumen comercial. Esto incluye la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Además, los patrones de expresión génica son consistentes entre ministats y una plataforma comercial de mayor volumen. Estabilidad de la tasa de dilución, la densidad óptica y la reproducibilidad de la expresión génica entre tres cultivos replicados demostrar la robustez de nuestra plataforma. También muestran que las mutaciones de adaptación surgen las mismas sobre escalas de tiempo similares evolución experimental como con quimiostatos de mayor volumen.
Cultivo en chemostat los ministats, como con cualquier chemostat, requiere atención al detalle y la resolución de problemas. Dado que la contaminación es de gran preocupación en experimentos con cultivos continuos, se suelen mirar a través de microscopio en busca de contaminación bacteriana y fúngica tras la inoculación y cada 50 generaciones durante experimentos de evolución a largo plazo. Hasta la fecha no hemos observado contaminación a través de 96 experimentos de evolución de más de 300 generaciones (datos no mostrados). Para la prueba de contaminación cruzada entre ministats y el potencial de microbios para colonizar la cámara de cultivo por medio de la línea de efluente que corrió 16 ministats tales que cada Ministat otro se inoculó con la levadura como anteriormente y el resto no se inocularon con cualquier cultura. Los cultivos se recogen en un contenedor de residuos comunales, que se vació cada dos días. Así, si fuera posible que los contaminantes para entrar a través de la línea de efluente que probablemente han observado que en este experiment. Durante tres semanas y más de 100 generaciones de crecimiento en este patrón de tablero de ajedrez de los cultivos inoculados y no inoculadas No se observó crecimiento en no inoculadas tubos de cultivo MINISTAT, lo que sugiere que la contaminación de la levadura u otros microbios exterior es poco probable que ocurra en los experimentos de marcos de tiempo similares.
Aunque los ministats fueron diseñadas para operar en un modo análogo a quimiostatos comerciales, la naturaleza modular de esta disposición permite la optimización para adaptarse a las necesidades del usuario y el presupuesto. La bomba peristáltica utilizada en este protocolo pueden lograr tasas de flujo entre 0,0186 vol / hora a 3,6 vol / h (datos no mostrados). Mayor control de las tasas de dilución se podría lograr con modelos de bombas alternativos. Tenga en cuenta que la operación a tasas de dilución inferiores pueden requerir la sustitución de una aguja de calibre más alto para lograr la misma frecuencia de entrega de las gotitas. Tamaño de la población es un factor importante para el diseño adecuado de los experimentos de evolución.La tasa de dilución estándar y la concentración de nutriente utilizado aquí proporciona un tamaño de población relativamente grande (~ 10 9 células) del mismo orden de magnitud que los estudios publicados evolución. 11 poblaciones más grandes o más pequeñas podría ser mantenida por cambiar el volumen de trabajo o limitar la concentración de nutrientes. Aumento en el suministro mutación también podría obtenerse trabajando con cepas con elevadas tasas de mutación.
Los ministats también podría ser mejorado en nuestro diseño actual. Por ejemplo, la condensación puede acumularse en las paredes del tubo de cultivo y se puede reducir considerablemente mediante el uso de un baño de agua profunda, incubadora, o sala a temperatura constante. Aunque aglutinación y crecimiento de la pared en sulfato de cultivos limitados parece ser relativamente poco frecuente, apareciendo en experimentos de evolución 5/48 por 300 generaciones (datos no mostrados), una variedad de tensioactivos están disponibles que pueden ayudar a disminuir o retrasar este rasgo. En el caso de que interfiere con la formación de grumos cultivo adecuadola mezcla y agitación, aumento se puede lograr mediante la reducción de la cantidad de formas se divide cada bomba de aire, o mediante la adición de un aparato de agitación. Sondas adicionales para la concentración de gas disuelto, pH, u otros parámetros también pueden ser incluidos, como en algunos otros diseños. 17
A pesar de las modificaciones posibles, utilizando los ministats como se describe en este protocolo, se observó parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por quimiostatos de mayor volumen comercial. Esto incluyó la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones (Figura 2A) y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Patrones de expresión génica fueron consistentes entre los tres repeticiones biológica en ministats y entre ministats y comerciales de gran volumen plataformas (Figura 2B), con la excepción de los genes del metabolismo de hierro. Estos expresión diferencias son causados probablemente por los cambios en el contenido de metal de los dos dispositivos o mejoras en la calidad de los ingredientes de los medios. Nuestros datos sugieren que ministats será útil para experimentos de fisiología o competición donde se requiere un ambiente consistente.
Para probar si el diseño Ministat es suficiente para aplicaciones evolución experimental que se desarrollaron culturas con limitación sulfato para 250 generaciones y CGH utilizado para caracterizar la amplificación del locus SUL1 -. Un sello de evolución a largo plazo en estas condiciones en quimiostatos mayor volumen 10 Observamos amplificación de SUL1 en clones de 4/4 experimentos de evolución independientes en sulfato limitados medios de comunicación (Figura 2C). Tomados en su conjunto estos datos sugieren que ministats son una plataforma robusta que puede ser útil para una variedad de aplicaciones chemostat tradicionales. A pesar de que ha demostrado su uso en el cultivo de levadura en ciernes, los ministats deberíatambién ser compatible con otros organismos y diseños similares, de hecho, han sido utilizados para el cultivo de bacterias y otras especies de levadura. 16,17,25 Además, el volumen menor cultura y la necesidad de una correlación disminuyó para los medios de comunicación pueden hacer ministats una alternativa atractiva para experimentos que requieren costosos o exóticos reactivos como puede ser el caso en química o cribados genéticos.
The authors have nothing to disclose.
Creación del video fue apoyado por becas del Centro Nacional para Recursos de Investigación (5P41RR011823-17) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (8 GM103533 P41-17) de los Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo también fue apoyado por NSF subvención 1120425. MJD es una Fundación Rita Allen Scholar. AWM es apoyado en parte por el NIH T32 HG00035. Damos las gracias a Anna Sunshine para obtener ayuda con la mejora de los protocolos. Además, reconocemos Sara DiRienzi, Payen Celia, y Sirr Amy como los primeros usuarios de los ministats.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |