Vi utvecklade och validerade en liten fotavtryck uppsättning miniatyr kemostater byggda från lättillgängliga delar för låg kostnad. Fysiologiska och experimentell utveckling resultat liknade större volym kemostater. Den ministat arrayen ger en kompakt, billig och lättillgänglig plattform för traditionella kemostat experiment, funktionell genomik och kemiska applikationer screening.
Kemostater är kontinuerlig odling i vilka celler odlas i en hårt kontrollerad, kemiskt konstant miljö där kultur densitet begränsas genom att begränsa vissa näringsämnen. 1,2 Data från kemostater är mycket reproducerbara för mätning av kvantitativa fenotyper som de ger en konstant tillväxt och miljö vid steady state. Av dessa skäl har kemostater blivit användbara verktyg för finskalig karakterisering av fysiologi genom analys av genuttryck 3-6 och andra egenskaper hos kulturer vid steady-state jämvikt. 7 långtidsförsök i kemostater kan lyfta specifika banor som mikrobiella populationer antar Under adaptiv evolution i en kontrollerad miljö. I själva verket har kemostater använts för experimentell utveckling eftersom deras uppfinning. 8 Ett vanligt resultat i evolution experiment för varje biologiska replikat att förvärva en unik repertoar av mutationer. 9-13 Denna mångfald tyder på att det mycket är kvar att upptäckas genom att utföra evolution experiment med mycket större kapacitet.
Vi presenterar här konstruktionen och driften av en relativt enkel, billig uppsättning miniatyr kemostater-eller ministats-och validera deras användning i bestämning av fysiologi och evolution experiment med jäst. Detta tillvägagångssätt innebär tillväxt av tiotals kemostater rinna av en enda multiplexerad peristaltisk pump. Kulturerna hålls vid en 20 ml arbetsvolym, vilket är praktiskt för en mängd olika tillämpningar. Det är vår förhoppning att öka genomströmningen, minska kostnader, samt om bygg-och instruktioner drift kan också motivera forskning och industriell tillämpning av denna design som en allmän plattform för funktionellt karakterisera ett stort antal stammar, arter och parametrar tillväxt samt genetisk eller läkemedel bibliotek.
Dynamiken i mikrobiell tillväxt och utveckling är grundläggande för mikrobiologi, ekologi, genetik och bioteknik. Den vanligaste metoden för odling mikrober är satsvis, där celler inokuleras vid låg densitet i näringsrik buljong och odlades till mättnad. Även enkel att utföra med standard laboratorieutrustning, batch kulturer upplever en fluktuerande kemisk miljö och motsvarande förändring cellulär fysiologi. Denna heterogena tillväxtmiljö kan resultera i sekundära tillväxt och stress effekter som kan maskera subtila fysiologiska skillnader. Experimentell evolution genom seriell parti överföring kan välja för komplexa blandningar av tillväxt-fas specifika undergrupper, komplicerar försök att ansluta anpassningar till specifika selektiva betingelser. Mätning av kvantitativa fenotyper kan vara svårt på grund av buller från oprecis prov timing och variation i funktioner som fördröjning. Kontinuerliga kulturer ger ett alternativtillväxt regim där celler kan reproducerbart odlas i ett kemiskt homogen miljö vid en definierad tillväxt för att nå ett fysiologiskt steady state. På grund av dessa fördelar, studier av experimentell utveckling och karakterisering av cellulära tillstånd använder ofta kontrollerad miljö av kontinuerliga kulturer som kemostat. 14
Värdering av dessa fördelar har lett till ett uppsving i intresset för kemostat kulturer. 15 Sedan de infördes 1950, har 1,2 kemostat system utvecklats för att fungera på en mängd olika skalor, från liter till mikroliter och för en mängd olika tillämpningar. 16 -19 Dessa olika utföranden, som sträcker sig från kommersiellt producerade bioreaktorer till glassblown fartyg till anpassade mikrofluidik plattformar, dela allmänna konstruktionsprinciper. En kultur kammare rörs och luftas (vanligtvis genom bubbling av luft genom det) och mikroberna däri hålls homogenaly dispergerat genom odlingskammare vid alla tidpunkter. Färskt medium med definierad komposition tillsätts kontinuerligt och tillsatshastigheten reglerar tillväxthastigheten och påverkar den kemiska miljön som upplevs av kulturen. Ett överflöde sätter odlingsvolymen i tillväxten röret, och genom denna bräddavlopp kulturen kommer att samplas vid samma takt som färskt medium in. På detta sätt kulturerna når snabbt ett fysiologiskt stationärt tillstånd vid vilken många biologiska parametrar förblir konstanta. Trots fördelarna med kemostater och rapporterna från dessa olika plattformar i litteraturen, har allmänt antagande begränsats av svårigheter att bygga och driva dessa system, och höga kostnader som är förknippade med kommersiella alternativ. Dessutom beskrivningar av hur man gör och använder dessa enheter kan vara ogenomskinligt.
Vi presenterar design och instruktioner för användning av en liten fotavtryck uppsättning miniatyr kemostater byggda från lättillgängliga delar till låg kostnad. Vi obsErve mycket konsekvent experimentella parametrar och reproducerbara resultat när man jämför vår enhet till rapporterade data för jäst odlas i större volymer kommersiella bioreaktorer. Detta inkluderar reproducerbarhet cellulär fysiologi sett genom att nå steady state jämvikt inom 10-15 generationer och få liknande kultur densiteter vid jämvikt. Dessutom genuttryck mönster är konsekventa mellan ministats och en kommersiell större volym plattform. Stabilitet av utspädning takt, optisk densitet och reproducerbarhet av genuttryck mellan tre likadana kulturer visar robustheten i vår plattform. Vi visar också att samma adaptiva mutationer uppstår jämfört med liknande experimentella evolution tidsskalor som med större volym kemostater.
Kemostat odling i ministats, som med alla kemostat kräver uppmärksamhet på detaljer och felsökning. Eftersom föroreningar är av stor oro i kontinuerlig odling experiment ser vi vanligtvis via mikroskop för bakterier och svampar föroreningar vid ympning och var 50 generationer under långsiktiga utvecklingen experiment. Hittills har vi inte observerat kontaminering över 96 evolution experiment större än 300 generationer (data ej visade). För att testa korskontaminering mellan ministats och potentialen för mikrober att kolonisera odlingskammare via utflödet linjen vi körde 16 ministats så att varannan ministat ympades med jäst som ovan och resten var inte ympas med någon kultur. Odlingarna provtogs i en gemensam avfallsbehållare, som tömdes varannan dag. Alltså, om det vore möjligt för föroreningar att komma in genom den utgående linje vi sannolikt skulle ha observerat att i detta experiment. Under tre veckor och mer än 100 generationer av tillväxt i denna rutmönster av ympade och icke-ympade kulturer vi inte observerar tillväxten i icke-ympade ministat odlingsrör, vilket tyder på att föroreningar utifrån jäst eller andra mikrober är osannolikt att ske i experiment liknande tidsramar.
Även om ministats var utformade för att fungera på ett sätt analogt med kommersiella kemostater medger modulära karaktären av detta arrangemang för optimering för att passa användarnas behov och budget. Den peristaltiska pumpen som används i detta protokoll kan uppnå flödeshastigheter mellan 0,0186 vol / h till 3,6 vol / h (data ej visade). Ökad kontroll över utspädning priser skulle kunna uppnås med alternativa pumpmodeller. Observera att drift vid lägre utspädningsgrader kan kräva ersättning av en högre nål för att uppnå samma frekvens droppe leverans. Befolkningens storlek är en viktig faktor för korrekt utformning av evolutionen experiment.Standarden utspädning ränta och koncentrationen av näringsämnen som används här ger en relativt stor befolkning storlek (~ 10 9 celler) av samma storleksordning som publicerats evolution studier. 11 Större eller mindre populationer kan upprätthållas genom att ändra arbetsvolym eller begränsa koncentrationen av näringsämnen. Ökad mutation utbudet kan också erhållas genom att arbeta med stammar med förhöjda mutation priser.
De ministats skulle också kunna förbättras över vår nuvarande utformning. Exempelvis kondens kan ansamlas på väggarna odlingsrör och kan minskas väsentligt genom användning av en djup vattenbad, inkubator, eller rum med konstant temperatur. Även klumpar och vägg tillväxt sulfat begränsade kulturer verkar vara relativt sällsynt, förekommer i 5/48 evolution experiment med 300 generationer (data visas inte), en mängd tensider är tillgängliga som kan hjälpa minska eller fördröja denna egenskap. I händelse av att klumpbildning stör tillräcklig kulturblandning, ökad omröring kan åstadkommas genom att minska antalet olika sätt varje luftpump delas, eller genom tillsats av en omrörare. Ytterligare prober för löst gas koncentration, pH, eller andra parametrar kan också inkluderas liksom i en del andra konstruktioner. 17
Trots potentiella ändringar, med hjälp av ministats som beskrivs i detta protokoll, observerade vi mycket konsekvent experimentella parametrar och reproducerbara resultat när man jämför vår enhet till rapporterade data för större volymer kommersiella kemostater. Detta inkluderade reproducerbarhet av cellulär fysiologi sett genom nå steady state jämvikt inom 10-15 generationer (figur 2A) och erhålla liknande kultur densiteter vid jämvikt. Gene expression patterns var konsekvent mellan tre biologiska replikat i ministats och mellan ministats och kommersiella stora volymer plattformar (Figur 2B), med undantag av gener järn metabolism. Dessa expression skillnader troligen orsakade av förändringar i metallinnehåll av de två enheterna eller förbättringar i kvaliteten på media ingredienser. Våra data tyder på att ministats kommer att vara användbar för fysiologi eller tävling experiment där en konsekvent miljö krävs.
För att testa om ministat designen är tillräcklig för experimentell utveckling applikationer vi utvecklade kulturer enligt sulfat begränsning för 250 generationer och används CGH att karakterisera förstärkning på SUL1 locus -. Kännetecknande för långsiktiga utvecklingen under dessa förhållanden i större volymer kemostater 10 Vi observerade amplifiering av SUL1 i kloner från 4/4 oberoende evolution experiment i sulfat-begränsad media (Figur 2C). Sammantaget antyder dessa data att ministats är en stabil plattform som kan vara användbara för en mängd olika traditionella kemostat applikationer. Även om vi visade deras användning i odling knoppande jäst, de ministats böräven kompatibel med andra organismer och liknande konstruktioner faktiskt har använts för odling av bakterier och andra arter jäst. kan göra ministats ett attraktivt alternativ för experiment som kräver 16,17,25 dessutom den mindre kultur volym och korrelerad minskat behov av media dyrt eller exotiska reagens som kan vara fallet i kemiska eller genetiska skärmar.
The authors have nothing to disclose.
Skapandet av videon har finansierats med bidrag från National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) och National Institute of General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) från National Institutes of Health. Detta arbete stöddes också av NSF bidrag 1.120.425. MJD är en Rita Allen Foundation Scholar. AWM stöds delvis av NIH T32 HG00035. Vi tackar Anna Sunshine för hjälp med att förbättra protokoll. Dessutom erkänner vi Sara DiRienzi, Celia Payen, och Amy Sirr som tidiga användare av ministats.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |