Her præsenterer vi en systematisk tilgang til udvikling af fysiologisk relevant, sensitiv og specifik<em> In vivo</em> Assays til tolkning variation i human patologi. Forbigående genetisk manipulation via mikroinjektion af WT og mutant menneskelige mRNA og morpholinogrupper (MO) antisenseoligonukleotider udnytte sporbarhed i udviklingslandene zebrafisk embryonet til hurtigt assay patogene mutationer, især, men ikke udelukkende, i forbindelse med humane udviklingsforstyrrelser.
Her præsenterer vi metoder til udvikling af assays til at forespørge potentielt klinisk signifikante nonsynonymous ændringer ved hjælp in vivo komplementering i zebrafisk. Zebrafisk (Danio rerio), er et nyttigt dyr system på grund af deres eksperimentelle sporbarhed, embryoner er gennemsigtige for at aktivere facile visning, undergår en hurtig udvikling ex vivo, og kan være genetisk manipuleret 1 Disse aspekter har tilladt for betydelige fremskridt i analysen af embryogenese. molekylære processer, og morfogenetiske signalering. Tilsammen fordelene ved denne hvirveldyr model gør zebrafisk særdeles modtagelig for modellering af udviklingsmæssige defekter i pædiatrisk sygdom og i nogle tilfælde, voksen-debut lidelser. Fordi zebrafisk genom er stærkt konserveret med som mennesker (~ 70% ortologe), er det muligt at rekapitulere humane sygdomstilstande i zebrafisk. Dette opnås enten ved injektion af mutant human MRNA at fremkalde dominant negativ eller gevinst på funktion alleler eller udnyttelse af morpholinogrupper (MO) antisenseoligonukleotider at undertrykke gener at efterligne tab af funktion varianter. Gennem komplementation af MO-inducerede fænotyper med udjævnede menneskelig mRNA muliggør vores tilgang fortolkningen af den skadelige virkning af mutationer på human proteinsekvens baseret på evnen af mutant mRNA at redde en målbar, fysiologisk relevant fænotype. Modellering af humane sygdoms alleler sker gennem mikroinjektion af zebrafisk embryoner med MO og / eller human mRNA på 1-4 celle stadiet, og fænotypebestemmelse op til syv dage efter befrugtning (dpf). Denne generelle strategi kan udvides til en bred vifte af sygdomsfænotyper, som demonstreret i følgende protokol. Vi præsenterer vores etablerede modeller for morfogenetisk signalering, craniofacial, hjerte-, kar-integritet, nyrefunktion og skeletmuskulatur uorden fænotyper, såvel som andre.
Den funktionelle fortolkning af genetisk information og tildeling af den prædiktive kliniske værdi til en genotype udgør et stort problem i medicinske genetik og bliver stadig mere gribende med den accelererende tekniske og økonomiske gennemførlighed af genome-wide sekventering. Derfor er det nødvendigt at udvikle og implementere nye paradigmer at teste patogenicitet af varianter af ukendt signifikans (VUS) opdaget i patienter. Disse assays skal derefter være nøjagtige, tid-og omkostningseffektiv, og havnen potentiale til at katalysere en overgang til klinisk anvendelighed.
Mens musen har traditionelt været det foretrukne værktøj inden for human sygdom modellering, er zebrafisk fremstår som en videnskabeligt og økonomisk favorable surrogat. I modsætning til mus giver zebrafisk biologi let og rettidig adgang til alle udviklingsstadier, hjulpet af optisk klarhed af embryoner, som giver mulighed for real-time scanning i udviklingslandene patologier. <sup> 1 Den relativt nylige generation af mutant zebrafisk linjer har givet yderligere test og modellering muligheder, ansat af mange i funktionelle undersøgelser, men denne teknologi fortsætter med at være begrænset (revideret i 1,38). Ikke alene er genetiske mutanter med knock-ins af specifikke mutationer besværlige at nå, er de heller ikke gøres til genstand for mellem-eller høj-throughput analyse til afprøvning af en række mutationer i et enkelt gen. Vigtigere, kan en enkelt række prøver give oplysninger ikke kun for den patogene potentiale af alleler, men også for retningen af virkning på celleniveau (f.eks tab af funktion vs gevinst funktion), som er afgørende for at informere arvegang i familier, små menneskelige stamtavler især når havnen begrænsede oplysninger om tilstanden af genetiske transmission. For yderligere sammenligning af brugen af tilgængelige mus og zebrafisk modeller se tabel 1.
Vi bemærker også, at denre er iboende begrænsninger for zebrafisk model system. Selvom D. rerio have hurtig indledende udvikling af organsystemer, seksuel modenhed kræver ca tre måneder. På grund af dette, er prænatal og pædiatriske-debut lidelser mest modtagelig for denne forbigående ekspression model. Mens ideel til udførelse store kemiske sammensatte skærme, er brugen af genetiske mutanter ikke muligt for systematisk test af tusindvis af nonsynonymous varianter, der bidrager til, og fortsætte med at blive opdaget i pædiatriske lidelser.
De komplementering test beskrives her drage fordel af denne eksperimentelle medgørlighed, høj grad af homologi, og bevarelse af funktion mellem humane og zebrafisk proteiner, især tilfældet for molekyler, der er nødvendige for konserverede udviklingsprocesser. Figur 1 skitserer afprøvning og identifikation strategi til forskellige allel effekter. Begge tab af funktion (LOF) og dominerende assays kan udføres. For LOF begynder eksperimentere med undertrykkelse af genet af interesse med en morpholino knockdown og analysering for fænotyper der kan være relevante for den kliniske fænotype under efterforskning. Undertrykkelse kan opnås enten ved at blokere translation ved at målrette en MO på eller nær translationsstartsted af zebrafisk locus (oversættelse blocker morpholino, tbMO), eller ved at interferere med splejsning ved at placere en MO på en splejsningsforbindelsen, typisk fremkalde enten optagelse af et intron eller afvigende exon skipping (splejsning blokering morpholino, sbMO).
Efterfølgende udjævnede mRNA fra ortologe menneskelige udskrift introduceret og kvantificerbare redning af fænotype måles. Når analysen er etableret, kan kandidat mutationer i humane budskab indføres og analyseret for deres evne til at redde MO-induceret fænotype på samme effektivitet som WT menneskelige mRNA. Omvendt for kandidat dominante alleler, human mRNA (men ikke MO) er introduktioned en forventning om, at WT menneskelige mRNA ikke vil groft påvirke zebrafisk anatomi og fysiologi, mens indførelsen af test mutationer, der har en dominerende effekt vil fremkalde fænotyper svarende til dem observeret i humane kliniske tilstand. Dette eksperiment kan være finkornet yderligere at dissekere om den dominerende effekt forekommer ved en forstærkning af funktion (GOF) eller en dominant negativ mekanisme ved at blande WT og mutant menneskelig mRNA, for GOF begivenheder, tilsætning af WT humant mRNA forventes at være irrelevante, bør der for dominant-negative alleler, blanding af WT og mutant mRNA ændre sværhedsgraden af fænotype induceret af mutant besked. I alle tilfælde anbefaler vi, at alle kombinationer af injektioner (MO med WT human mRNA vs morpholino med mutant human mRNA etc. skal udføres, helst inden for samme kobling af embryoner (se figur 1) Fortolkning er som følger.:
For LOF tests:
For dominerende tests:
Beredskabsplan:
De her beskrevne metoder repræsenterer en generel protokol for analysen af nonsynonymous ændringer i forbindelse med en række humane genetiske sygdomsfænotyper (tabel 2, figur 3). Vores metoder har vist sig nyttig til at vurdere de potentielle konsekvenser af variation på sygdomsfænotyper, og for at hjælpe dissekere sygdomsmekanismer (såsom bidrag dominerende negative mutationer til Bardet-Biedl syndrom, en primært autosomal recessiv sygdom 17). Til dato, gennem udvikling af den forelagte beslutning træet har vi modelleret til en rimelig pris og tid på over 200 gener kausalt forbundet med genetiske sygdomme, til et overskud af 1.000 alleler.
Selvom det ikke er diskuteret i detaljer her, har vi også vist, at disse metoder er hensigtsmæssige til at modellere andre typer af genetiske læsioner, såsom kopi nummer varianter (CNVs), samt og genetiske interaktioner. Analyser af sådanne begivenheder er uden for rammerne afden foreliggende fremgangsmåde beskrivelse, selvom de fundamentalt afhængige af samme princip systematisk test af kandidatgener (herunder par af gener injiceret samtidigt) for at bestemme induktion eller forværring af klinisk relevante fænotyper. For eksempel kan at belyse, hvilke af de 29 gener i 16p11.2 CNV være relevante for den observerede mikrocephali observeret hos patienter med gentagelser af et 660 kb genomisk segment, mRNA'er svarende til hver af de 29 gener i segmentet blev injiceret og hoved størrelse målinger blev foretaget på 2 dpf og 5 dpf, afslører et stort bidrag af et enkelt afskrift, KCTD13. 21. Derudover har vi brugt denne model til assay genetiske interaktioner af genomiske læsioner hos patienter med både Bardet-Biedl syndrom og Hirschsprung sygdom. 22. ved sammenligning af MO undertrykkelse af de kausale gener af de to kliniske identiteter separat og samtidigt, var vi i stand til at identificere den resulterende fænotype som being en synergistisk vekselvirkning snarere end blot additiv sværhedsgrad.
Trods have etableret høj følsomhed (98%) og specificitet (> 82%) for varianter bidrager til ciliopathies 17, har vi ikke endnu har tilstrækkelige data til at afgøre, om disse er generaliserbare til alle fænotypiske readouts i zebrafisk modeller. For at gøre dette, et stort antal alleler, forudsagde genetisk at være enten godartet eller patogene, skal testes inden hver fænotypisk kategori. Dette vil være særlig vigtigt for gennemførelsen af sådanne analyser i kliniske omgivelser, kan hvor funktionel fortolkning af VUSS informere diagnosticering og behandling kun, hvis en robust forståelse af falsk positive og falsk negative kan ledsage levering af sådanne resultater til læger og patienter. Ikke desto mindre kan disse metoder bidrage væsentligt mod en bedre forståelse af landskabet i menneskets genetiske sygdomme. Vi forventer, at disse modeller ikke kun vil tjene som en grundvoldeling for bedre tolkning af klinisk genetisk information, men vil også blive ansat som nyttige modeller til at gennemføre terapeutiske skærme. In vivo data kan også sammenlignes med i silico beregningsmæssige forudsigelser fra kilder såsom PolyPhen 23 SIFT 24 SNPs & GO 25 eller MutPred 26 at vise konkordans. Bemærk, at i en tidligere undersøgelse af forudsigelse databaser SNPs & GO og MutPred fandtes at være den mest præcise, med nøjagtigheder nåede kun 0,82 og 0,81, hhv. 27.
Selvom vi har skitseret robustheden af disse metoder til en delmængde af pædiatriske anatomiske defekter (tabel 2, figur 3), visse fænotyper er mindre medgørlig ved disse fremgangsmåder. Nogle undtagelser trods, er der tre primære klasser af lidelser ikke gøres til genstand for vores protokol. Voksen-debut lidelser (såsom Parkinsons sygdom) er en udfordring at modellere i et embryo system. Langsom progression degenerative fænotyper (såsom frontotemporal demens) kan kræve mere tid end de syv dpf vindue MO aktivitet at producere en fænotype. Andre gen knockdown teknologier såsom RNAi og siRNA er tilgængelige til at forstyrre eller forringe genet mål, men det har vist sig, at ingen er så specifik, stabil, ikke-toksisk, eller langvarig da MOS 28, hvilket også vil begrænse den tidsramme for fænotypebestemmelse. Tredje, nogle hvirveldyr strukturer, såsom pattedyr lunge, ikke har en tilstrækkelig ortologe struktur i zebrafisk embryoet. Vi har også givet en foreslået beredskabsplan for efterforskning af de tilfælde, hvor WT human mRNA injektion medfører en fænotype, selvom vi advare dette er en usædvanlig og uønsket situation.
Visse sygdomsfænotyper kan så kræve en større grad af abstraktion og rugemødre. Det er muligt, at genfunktion har afveget tilstrækkeligt til at svække fænotypisk lighed mellem model og true fænotype, eller at zebrafisk fysiologi sagens natur komplicerer virkningerne af den inducerede sygdom. I sådanne tilfælde foreslår vi yderligere dissektion af den producerede fænotype før afskedigelse. Vi har produceret nogle vellykkede eksempler på, hvilke problematiske fænotyper for dette assay er blevet modelleret i zebrafisk embryoner. For eksempel mutationer i TCF8 blev et gen forbundet med Fuchs hornhinde dystrofi (FCD), analyseret ved hjælp af vores protokol ved at bruge gastrulation defekter som surrogat fænotypisk udlæsning baseret på de kendte roller denne udskrift i den tidlige udviklingsfase. 29. I andre tilfælde, som f.eks som voksen-debut muskelsvind forårsaget af mutationer i DNAJB6 var vi i stand til at generere myofiber fænotyper i 5dpf embryoner trods det faktum, at mennesker er berøvet mærkbar muskel patologi i deres første tre til fire årtiers livet. 19.
Ud over de forbigående mutant modeller, der præsenteres her, andre har også taget Advantage af denne forbigående system modellere human sygdom i en række af kroppens systemer. I et eksempel blev retinitis pigmentosa modelleret i zebrafisk ved knockdown af genet RP2, hvilket resulterer i retinal celledød og nedsat retinal laminering. Rescue med humant vildtype-mRNA resulterede i udviklingen af alle tre lag af retinal laminering, mens fire ud af fem mutant mRNA'er undladt at redde. 30. Selv om denne model af en human sensorisk lidelse er baseret på en morfologisk fænotype, er det også muligt at assay respons på stimuli, såsom akustisk forskrækkelse eller præimpuls hæmning. 47.
For nylig blev en zebrafisk model, der anvendes til at undersøge Alzheimers sygdom patogenese gennem amyloidprecursorprotein. 31 Forfatterne viste, at genet knockdown forårsagede forringet axonal udvækst af motoriske neuroner, som kunne reddes med human mRNA. Denne model har vist sig at være særligt informativ, da musemodeller kun vise subtil phenotypes (single knockdown) eller postnatal embryoletaliteten (dobbelt knockdown). Evnen til at vurdere de zebrafisk embryoner in vivo hele udviklingen hjulpet at skelne patogene virkning af reduceret amyloidprecursorprotein, samt forudsat direkte bevis for, at proteinet kræver både et ekstracellulært og intracellulære domæne for korrekt funktion. Andre bemærkelsesværdige modeller omfatter, at yderligere muskeldystrofier 32, Diamond Blackfan anæmi 33, Axenfeld-Reiger syndrom (okular og kraniofaciale udvikling) 34, inflammatorisk tarmsygdom 35 (antibakteriel aktivitet), Parkinsons sygdom 36 (neuron og bevægelse tab), og beslaglæggelse 37. (hydrocephalus og hyperaktivitet).
Mere almindeligt er mutant zebrafisk linjer, der er blevet vist også at rekapitulere en menneskelig sygdom fænotype. Bedømt i 1,38, modeller omfatter leukæmi, melanom, udvidede kardiomyopati, Duchenne muskeldystrofi,og mange andre.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtte fra en Duke University Dean Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) stipendium 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) tilskud R01-EY021872 fra National Eye Institute (EED) R01HD04260 fra National Institute of Child Health og Udvikling (NK), R01DK072301 og R01DK075972 fra National Institute of Diabetes Digestive og nyresygdomme (NK), og Den Europæiske Union (Finansieret af EU 7 th FP under GA nr. 241.955, projekt SYSCILIA,. EED, NK) NK er en Distinguished Jean og George W. Brumley Professor.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |