Summary
Здесь мы представляем систематический подход к разработке соответствующих физиологически, чувствительность и специфичность
Abstract
Здесь приведены методы для развития анализов для запроса потенциально клинически значимых изменений несинонимичных использованием в естественных условиях дополнения в данио рерио. Данио рерио (Danio рерио) являются полезной системы животных в связи с их экспериментальными уступчивость; эмбрионы являются прозрачными для легкого включить осмотр, подвергаются быстрому развитию естественных бывшие, и может быть генетически модифицированных 1 Эти аспекты позволили значительные успехи в анализе эмбриогенеза. молекулярные процессы и морфогенетические сигнализации. Взятые вместе, преимущества этой модели позвоночных сделать данио наиболее подходящей основы для моделирования дефектов развития у детей заболеваний, а в некоторых случаях, во взрослом возрасте нарушений. Поскольку генома данио высоко консервативен с у человека (~ 70% ортологи), можно резюмировать человека болезненных состояний данио рерио. Это достигается либо за счет введения мутантного человеческого мРНК чтобы вызвать доминантных негативных или усиления функции аллелей, или использование морфолино (MO) антисмысловые олигонуклеотиды, чтобы подавить гены, чтобы имитировать потерю функции вариантах. Через комплементации MO-индуцированной фенотипов с крышками мРНК человеческого, наш подход позволяет интерпретации вредного влияния мутаций на последовательность человеческого белка основано на способности мутантных мРНК, чтобы спасти измеримыми, физиологически значимых фенотип. Моделирование человеческого аллелей болезни происходит через микроинъекции эмбрионы рыбок данио с Мо и / или мРНК человека на 1-4 клеточной стадии, а фенотипирование до семи дней после оплодотворения (DPF). Эта общая стратегия может быть распространен на широкий круг заболеваний фенотипы, как показано в следующей методике. Мы представляем наши модели созданы для морфогенетических сигнализации, черепно-лицевые, сердечные, сосудистые целостности, функции почек, скелетных мышц фенотипа расстройства, а также другие.
Introduction
Функциональная интерпретация генетической информации и присвоение интеллектуального клинического значения генотипа представляет основную проблему в медицинской генетике и становится все более острой с ускоряющим технической и экономической целесообразности генома секвенирования. Таким образом, необходимо разработать и осуществить новые парадигмы для проверки патогенности варианты неизвестного значения (VUS) обнаружены у пациентов. Эти анализы должны затем быть точным, времени и экономически эффективной, и гавань потенциал, чтобы стимулировать переход к клинической полезности.
В то время как мыши традиционно инструментом выбора в области моделирования человеческих заболеваний, данио становятся научно и экономически благоприятных суррогат. В отличие от мыши, данио биологии позволяет легко и своевременный доступ к всех стадиях развития, опираясь на оптическую прозрачность эмбрионов которая позволяет в режиме реального времени изображения развивающихся патологий.
Отметим также, чтоRe присущи ограничения на данио модели системы. Хотя D. рерио имеют быстрое начальное развитие органов и систем, половой зрелости требуется приблизительно три месяца. Из-за этого, пренатальной и педиатрического начала расстройства являются наиболее поддаются этого переходного модель выражения. Хотя идеально подходит для проведения больших экранах химическое соединение, использование генетических мутантов не представляется возможным для систематического тестирования тысяч несинонимичных варианты, которые способствуют, и продолжают быть обнаружены в педиатрической расстройств.
Дополнения испытания, описанные здесь, воспользоваться этой экспериментальной уступчивость, высокой степенью гомологии, и поддержания функции между человеком и рыбок данио белков, в частности, так и для молекул, необходимых для консервативных процессов развития. Рисунке 1 представлены тестирования и стратегии идентификации для различных эффектов аллеля. Оба потери функции (LOF) и доминирующей анализы могут быть выполнены. Для LOF, эксперимент начинается с подавления гена с морфолино нокдаун, и анализа на фенотипы, которые могут иметь отношение к клиническим фенотипом под следствием. Подавление может быть достигнута либо путем блокирования перевод от ориентации MO на или вблизи поступательного сайт начала данио локус (перевод блокатор морфолино; ТБМО), либо путем вмешательства сплайсинга, поместив MO на сплайсинга, обычно вызывая либо включением интронов или аберрантными пропуска экзонов (Слить блокирование морфолиногруппы; SBMO).
Впоследствии, капо мРНК из ортологичных человека транскрипт введен и количественно спасательных фенотипа измеряется. После анализа установлено, кандидат мутации в человеческом сообщение может быть введен и анализировали на их способность спасти MO-индуцированной фенотип при той же эффективности, как WT человеческой мРНК. Наоборот, для кандидата доминантные аллели, человеческая мРНК (но не МО) при введенииЭд с ожиданием, что WT мРНК человеческого не будет грубо влиять данио анатомии и физиологии, в то время как введение теста мутаций, которые имеют доминирующее влияние будет вызывать фенотипа аналогичные тем, которые наблюдались в человеческом клинического состояния. Этот эксперимент может быть мелкозернистой дальнейшего препарировать ли доминирующий эффект происходит за счет усиления функции (ГОФ) или доминантно-негативный механизм путем смешивания WT и мутантных мРНК человеческого, ибо события ГОФ, добавление WT мРНК человеческого как ожидается, будет значения, в то время как для доминантно-негативный аллелей, смешивание дикого типа и мутантных мРНК должны изменять тяжести фенотипа индуцированного мутанта сообщение. Во всех случаях, мы рекомендуем, что все комбинации инъекций (MO с WT против мРНК человеческого морфолиногруппу с мутантным человека и т.д. мРНК быть выполнены, предпочтительно в пределах одного сцепления эмбрионов (см. Рисунок 1) интерпретация состоит в следующем.:
Для LOF тесты:
- Если нокдаунпроизводит фенотип которые могут быть спасены эквивалентно мутантными и WT мРНК, аллель может доброкачественной.
- Если мутант спасения нокдаун фенотип неотличимо от нокдауна фенотип сама, аллель является вероятным функциональное значение NULL. Эксперимент не может различать между истинным нули (без функционального белка) и сверхнизких уровней активности белка, которые не имеют спасательные мощности.
- Если мутант спасения нокдаун фенотип является статистически лучше, чем МО, но хуже, чем WT, аллель, скорее всего, как hypomorph Этот результат демонстрирует, частичная потеря функции.
Для доминирующего тесты:
- Если нет нокдаун фенотип, но инъекции мРНК WT производит фенотипа, резервный план должен быть использован, если эксперимент продолжить (см. ниже).
- Если нет фенотип нокдаун и инъекции WT мРНК не приводит к фенотипу, эксперимент продолжается, как обычно.
- Если инъекциимутантных мРНК эквивалентно дикого типа мРНК, аллель может быть доброкачественными или потери функции, или анализ может не увенчались успехом. Это требует дальнейших экспериментов для различения этих вариантов.
- Если инъекции мРНК мутантного неотличима от нокдаун MO, функции генного продукта, вероятно, изменены в некотором роде. Чтобы различать изменение функции титрования мутант мРНК дикого типа мРНК должна осуществляться.
- Если в результате этого титрование неотличима дикого типа мРНК один, было показано, что мутантные белковый продукт использует белок дикого типа в качестве субстрата, а его действие изменяется с количеством титрования. Это указывает на то доминантный негативный фенотип.
- Если в результате этого титрование неотличима к мутантным мРНК один, было показано, что мутантные белковый продукт больше не выполняет ту же функцию, как дикого типа, и, следовательно, не зависит от количества дикого типа предварительно белковый продуктотправлен. Это показывает, что аллель, вероятно, усиление функции.
Резервный план:
- Если ни один не представляет фенотип от нокдауна MO, но делает с настоящим WT мРНК, дальнейших экспериментов может произойти, хотя мы подчеркиваем, что эта ситуация не является идеальной. WT мРНК человеческого следует титровать, чтобы минимизировать фенотипа, а также может быть использован в качестве новой уставки. Далее инжекции из дикого типа и мутантного человеческого мРНК может быть оценена на основе спасение способность мутанта.
Protocol
1. Биоинформатика анализ
- Определить, если человеку интерес ген имеет данио Ортолог, и если да, то сколько копий. Мы рекомендуем взаимных BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ) человеческого белка против генома данио рерио и последующее BLAST из лучших данио удар против человеческого генома. Правда ортологам будет лучший хит в каждом случае.
- Определить размер открытой рамки считывания (ORF) гена человека. Если более 6 кб, эта модель является неразрешимой в настоящее время из-за ограничения высокого качества в пробирке транскрипции длинных шаблонов.
- Получить или генерировать конструкцию, содержащую человека ORF в PCS2 векторных позвоночника (или эквивалентный вектор с 5 'SP6 сайте транскрипцию и 3' поли сигнала).
- Дизайн MO блокировать сплайсинга или перевод целевого гена рыбок данио. Если множестве копий в геноме данио, термоэлектронной два варианта: а) разработка дополнительных МО, или б) определение сайта сплайсинга полностью сохранившимся между копиями, против которых одного MO может быть эффективным. Некоторые опубликованы MO последовательности доступны в www.zfin.org .
2. Анализ экспрессии в развивающихся эмбрионов рыбок данио
- Определить, если Ортолог данио выражается в пространственно-временной связи, относящиеся к фенотипическим считывания. Если никакого выражения данные не доступны для интересующего гена, проведение обратной транскрипции (RT)-PCR с использованием кДНК из цельного эмбрионов данио или в гибридизация. (См. 2,3).
3. Сайт-направленного мутагенеза
- Дизайн праймеров мутагенеза 25-45 оснований в длину, с желаемой мутации в центре. Температура плавления грунтовка должна быть больше или равна 78 ° С. Дизайн прямом и обратном мутагенеза для отжига праймеров к противоположнымнити плазмиды.
- Получение праймеров для последовательности подтверждения ORF после мутагенеза, эти плитки должны через ~ 300 пар оснований разделов, чтобы покрыть всю ORF.
- Соберите реакцию мутагенеза с высококачественным полимеразы и цикл следующим образом (1: 95 ° C 30 сек, 2: 95 ° С 30 сек, 3: 55 ° С 1 мин, 4: 68 ° C 6 мин, 5: Перейти 18x до 2, 6: 4 ° C навсегда, 7: конца).
- Добавить 1 мкл ограничение DpnI эндонуклеазы на реакцию, чтобы удалить плотины метилированный шаблон; инкубировать при 37 ° С в течение 2 часов.
- Преобразование 2 мкл реакцию мутагенеза в 20 мкл компетентных клеток в соответствии со стандартными протоколами.
- Возьмите 3-4 колоний и привить 5 мл LB среды, содержащей соответствующий антибиотик. Встряхнуть при 37 ° С в течение ночи при 225 оборотах в минуту.
- Miniprep ДНК и определить концентрацию.
- Последовательность сайт мутации, чтобы подтвердить присутствие мутации интерес.
- Последовательность всей ORF для подтверждения целостности последовательности.
4. В пробирке транскрипции мРНК
- В рамках линеаризованной шаблона PCS2 +, генерировать крышками мРНК с использованием mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion). Мы рекомендуем использовать половину количества компонент реакции.
- Очищают образцов РНК с LiCl осаждение или фенол хлороформ, как описано в инструкции к набору.
- Определить концентрацию мРНК с использованием поглощения, обеспечить целостность мРНК с использованием гель-электрофореза, и хранить образец в трех или более аликвотах при -80 ° С до готовности к использованию. Мы не рекомендуем несколько циклов замораживания-оттаивания мРНК аликвоты.
5. В естественных условиях анализа варианта потеря функции
- Получение эмбрионов рыбок данио из натурального вязки данио, и поддерживать их при 28 ° С в зародыше воды в 6 или 10 см блюд.
- Провести ответ морфолиногруппу кривой доза для оценки фенотипа специфичность, эффективность и МО МО токсичности. Введите дозировку кривой намере три различных концентрациях в диапазоне 1-10 нг MO в 50-100 (1-4 клеточной стадии) эмбрионов рыбок данио / партии. Эффективное МО должно приводить к зависимое от дозы увеличение доли пострадавших эмбрионов в пакете.
- Фенотип эмбрионов на соответствующие стадии развития на основе экспрессии целевого гена данио интереса и этап, на котором соответствующий фенотип будут соблюдены. Это может быть либо количественными (например, измерение между анатомических структур) или качественной (на основе стандартизированных фенотипических критериям). Для всех инъекций набрал> 24 HPF: эмбрионы следует относиться с ПТУ (0,003% 1-фенил-2-тиомочевины в эмбрион СМИ) при 24 HPF, чтобы максимальное снижение меланоцитов формирования.
- Для сплайсинга блокирование МО, тест MO эффективность путем экстракции тотальной РНК из цельной эмбрион лизатов в момент времени фенотипических счет, генерировать кДНК и проводить RT-PCR гена-мишени с использованием праймеров, фланкирующих сайт MO цели.
- Чтобы убедиться в подавлении EFFICiency из TB-MO, урожай лизаты белка эмбриона и провести иммуноблоттингу сравнить уровни белка-мишени по сравнению с контролем. Однако этот подход не поддается все гены-мишени, поскольку существует ограниченный перекрестной реактивности для многих коммерческих антител к данио белков. Два косвенных методов показывает MO специфичности, включают: а) демонстрирует, что существует зависимое от дозы эффект на фенотип, и б) показывает, что совместное введение дикого типа мРНК с ТБ-MO спасает фенотип эффективно. По этой причине, мы рекомендуем сращивания блокаторов, когда это возможно, потому что эффективность можно контролировать напрямую.
- Если фенотип наблюдается перейдите к пункту 5.7, если ни фенотип не наблюдается перейдите к шагу 6.1.
- Для качественного фенотипы, выберите доза МО, в котором 50-75% эмбрионов страдают; для количественного фенотипы, выберите доза МО, в котором мера фенотипического значительно отличается от дикого типа (р <0,001). Вводите новые партии данио набryos (1-4 клеточной стадии, N = 50-100/batch) с коктейлем содержащие "анализа" дозу Мо и дозировки кривой мРНК человеческого WT (от 10-200 мкг мРНК; эти дозы обеспечить существенное сверхэкспрессию выше базовый какой-либо одной стенограммы, представляющих 0,25-0,5% от общего числа мРНК Пойа эмбрионов рыбок данио). 4
- Проведение масках озвучивание инъекции партий; выбрать WT дозы мРНК с наиболее значительными спасательного по сравнению с МО в одиночку, это "анализ" доза мРНК.
- Вводите новые серии (1-4 клеточной стадии, N = 50-100/batch) с анализом дозы Мо и анализа доз мутантных мРНК человеческого. Фенотип эмбрионов на соответствующем этапе и сравнивать результаты с WT человека спасательных мРНК с использованием соответствующих статистических тестов (Т-тест или хи-квадрат). См. рисунок 1 для результатов и перейдите к шагу 7. Введите анализа доз дикого типа и мутантных мРНК только для контроля эффектов мРНК токсичности.
6. В естественных условиях анализа варианта Dominant отрицательная или увеличение функции Эффекты
- Если никакой потери функции фенотип не наблюдается (шаг 5,5), или если мутант мРНК приводит к фенотипов существенно не отличались от MO один (шаг 5.7), вводят дозу кривой в пределах от 10-200 мкг мРНК человеческого WT (рекомендуем 25, 50 и 100 пг в качестве первоначального испытания) в эмбрионе партиями (1-4 клеточной стадии; 50-100 эмбрионов / партии).
- На соответствующем этапе (см. п. 5.3 выше), проводят фенотипических забил, и определяют высокие дозы, при которой нет статистически значимого количества погибших и / или пострадавших эмбрионов по сравнению с uninjected управления. Это "проба" дозу.
- Введите анализа дозой мутантного человеческого мРНК (1-4 клеточной стадии; 50-100 эмбрионов / партии). Фенотип эмбрионов и сравнить результаты к голу из анализа доза WT человека инъекции мРНК или концентрации для анализа МО. См. рисунок 1 для результатов.
- Если результаты не отличаются от МО, титрование человека мутантных мРНК с мРНК WTи сравнить с человеческим WT и мутантных инъекции мРНК. Улучшение с мутантным фенотипом плюс WT мРНК впрыском партий указывает на доминантный негативный. Улучшения не указывает на увеличение функции.
7. Размножаться в естественных условиях результаты тестирования
- Повтор в естественных условиях анализа, как минимум, три раза.
8. Интеграция данио рерио в естественных данных патогенности с другими линиями доказательств
- Сравните патогенность данных, полученных в экспериментах на рыбках данио: генетические данные в родословную (если применимо), управления данными населения частоты, в лабораторных исследованиях (на основе клеток стабильности белка, клеточной локализации, выхода сигнализации, или ферментативной активности).
Representative Results
Рецессивные расстройства и Pseudorecessive
Первичные реснички почти вездесущих структур на позвоночных строение тела, которые играют клеточных сигнальных роли в судьбах нескольких клеток, включая пролиферацию, полярности, дифференцировки и поддержания тканей. 5 Дисфункция этих органелл приводит к широкому спектру человеческих генетических нарушений, отмеченных под общим названием цилиопатий. 6,7 Одним из таких является клинической лица Барде-Бидля (BBS), мультисистемное педиатрическое заболевание, характеризующееся дегенерацией сетчатки, ожирение, гипогонадизм, полидактилия и нарушение функции почек. 7 Развитие Исследования in vivo аллеля патогенности было необходимо для BBS потому что а) она является генетически гетерогенную заболевание, вызванное в первую очередь частный несинонимичных изменений, возникающих в по меньшей мере 17 генов 7-10, и б) oligogenic наследование в> 25% BBS семей, где присутствие гетерозиготных изменения второгоBBS ген (в дополнение к рецессивным основной причинной мутации) могут модулировать клинических проницаемость и выразительность. Как правило, такой третьей аллели несинонимичных гетерозиготных изменения, от генетической точки зрения, неясно потенциальные патогенные, что требует точной интерпретации их биологическое воздействие на функции белка. 11-13
Для исследования потенциальных патогенных мутаций способствует мутационные нагрузка в BBS, мы изначально проверили все Миссенс изменений, указанных в BBS1 - BBS14. И мы, и другие показали, что потеря белков базальной тела вызывает нарушение регуляции клеточной полярности плоских (PCP; неканонических Wnt сигнализации). Проявляющиеся в виде сходящихся дефектов расширением в середине сомитного эмбрионов данио 14 Используя это физиологически соответствующие фенотипические считывания, мы обнаружили, что подавление BBS генов привело к сокращению осей тела, более широкие и тоньше сомитами, и широкие, перегибов notochords. 15 </ Вир> (рис. 2) MO-индуцированного подавления дефектов производится гаструляции, а также совместного инъекции мРНК человеческого спас значительно (и воспроизводимо) эти фенотипы как забил три различных методов в естественных условиях. Во-первых, эмбрионы были забиты живыми по качественным критериям фенотипические (нормальный, класс I и класс II, для детального определения фенотипических классов см. 15). Далее, мы количественно клеточную миграцию во эпиболии (ранняя стадия развития характеризуется истончением и распространения слоев клеток на ячейку желтка 16) с использованием флуоресцеина Tracer для визуализации мигрирующих клеток. Наконец, мы измерили сомита длина магистрали в девяти сомитов эмбрионы на месте гибридизованы с коктейлем из Krox20, pax2 и MyoD рибозондами, которые были установлены плоские для морфологического анализа.
Эта методология была использована для проверки более 500 аллелей в цилиарной мутационные пространстве. В одномучиться самостоятельно, в естественных условиях тестирования> 130 аллелей подготовлен целый ряд фенотипических баллов; как показали наши протокола (рис. 1) в комплекте спасает были классифицированы как доброкачественные (не существенно отличается от спасательных WT), частично спасает были классифицированы как hypomorphs (значительно улучшилось из Мо, но более серьезными, чем спасательные WT), неспособность спасательных были классифицированы как функциональная нулевого (не существенно отличается от MO) и фенотипа индуцированного мутанта мРНК только по сравнению с МО были классифицированы как доминирующей негативов.
Мы также оценивали чувствительность и специфичность в естественных условиях дополнения анализа у рыбок данио. Специфичность была подтверждена совместного инъекционного общее SNPs (> 5% незначительные частота аллеля в здоровой популяции контроля); эти было установлено, при доброкачественных фенотипов в 14/17 испытания (> 82%) и чувствительности было показано, что 98%, как указано по согласованию между данными в естественных и генетических аргументы достаточными тO Атрибут аллеля как причинные в BBS родословной. 17 Кроме того, фенотипические эффекты, наблюдаемые с помощью трех в естественных мер (живой забив, эпиболии отслеживания и ISH морфометрии) были подтверждены в пробирке использованием иммуноблотингом и клеточных исследований локализации. В то время как интерпретация этих результатов требуется предварительное знание по крайней мере один механизм патогенеза заболевания, в этом примере предоставляет доказательства в обоснование полезности и надежности нашего протокола. С тех пор мы подтвердили нашу в естественных условиях забил с нескольких других линий экспериментальных свидетельств в беспристрастной мутационный скрининг и функциональное исследование анализа TTC21B, ретроградная intraflagellar транспортного белка. 18
Доминирующие расстройствам
Пояс конечностей мышечные дистрофии (КПМД) являются аутосомно-класс мышечная дистрофия, вызывает медленный прогрессирующая слабость мышц в области бедер и плеч. Это генетически и меняchanistically гетерогенной группы заболеваний обусловлен как доминантные и рецессивные мутации в нескольких сарколемных, саркомерные, цитоплазматических и ядерных белков. На основании представления клинического фенотипа и доказательств поражения мышц от магнитно-резонансной томографии, мы исследовали причины доминирующего КПМД найти в финском, США и итальянских семей 19. Секвенирование позиционных кандидатов в пределах отображенного локусе показало DNAJB6 мутации в ген, кодирующий совместно шаперона HSP70 в семье выражается в виде по меньшей мере два соединения изоформы (ядерные и цитоплазматические) у людей. Чтобы получить более полное представление о DNAJB6 функции и ее отношение к КПМД, мы изучили его роль в целостности мышц у рыбок данио. ОТ-ПЦР из рыбок данио Ортолог (dnajb6b) обнаружены выражение еще в пяти сомитов, который был с последующей инъекцией эмбрионов с сращивания-блокирование морфолиногруппу. Через 48 часа после оплодотворения, показали масках забил отряд медленнымВолокна от их точки вставки. Специфика этого фенотипа затем испытывали со вторым неперекрывающимися MO и спас затем с WT человека DNAJB6 мРНК.
Чтобы запросить как потеря DNAJB6 функции приводит к дефектам в мышечных целостности, мы ввели Миссенс мутации обнаружены у пациентов в человеческую стенограммы обеих изоформ и вводят их в эмбрионы рыбок данио. В то время как инъекции WT мРНК человеческого не дали заметного фенотип, эти изменения phenocopied потери функции эффектов MO когда инженерии в цитоплазматической, но не ядерный изоформы. За этим последовало инжекции эквимолярных количеств мутантных и WT мРНК, которая показала расширенные тяжести мышечного фенотип, что указывает на доминирующее влияние. Чтобы проверить это понятие, дальнейшие инъекции проводились с изменения молярных отношений мутант и WT мРНК. В соответствии с предсказанием, избыток мутант мРНК по сравнению с WT который вызывает гибель зародышей, в то времяN превышение WT производится постепенно увеличивается спасения. За этим последовали в пробирке эксперименты по определению oligimerization свойств и возможных взаимодействий белка. Они показали, что мутации ухудшают антиагрегационной активностью цитоплазматической DNAJB6 и мешать оборота оба мутантных и WT, а также взаимодействовать с другой молекулой, BAG3, который также имеет отношение к патологическим КПМД, так LOF BAG3 вызывает педиатрические формы мышечной дистрофии 20. Мы тогда спросили, могли ли BAG3 модулирует фенотип индуцированного мутанта DNAJB6b у рыбок данио. В то время как инъекции WT BAG3 только не дали фенотип, совместной инъекции с DNAJB6 мутантов значительно увеличить фенотипических тяжести, предполагая, что BAG3 играет важную роль в опосредовании патогенности таких мутантов 19.
| Переходная модель данио рерио | <TD> Мутант линию данио рериоТрансгенных мышей линии | ||
| Возраст начала фенотипа человека под следствием |
|
|
|
| Возможные Фенотипы |
|
|
|
| Время до использования (от рождения) | 1-7 дней | > 3 месяца | > 6 месяцев |
| Пропускная способность | средне-высокий | низкий | низкий |
| Преимущества |
|
|
|
Таблица 1. Сравнение моделей в естественных условиях.
Таблица 2. Примеры в естественных условиях моделирования человеческого dysmorphologies. Различные фенотипы испытан под представлен протокол. Диапазон фенотипических показания и методы визуализации могут быть использованы в зависимости от типа беспорядка. Нажмите здесь, чтобы увеличить таблицу.
Рисунок 1. В естественных условиях функционального тестирования несинонимичных вариантах. Системный подход к функциональному тестированию всехугрей неизвестных или предположили значение. Ген нокдаун помощью микроинъекции морфолино следует ряд (со) инъекции и дикого типа и мутантного человеческого мРНК. Статистический анализ результатов фенотипического информировать патогенности аллелей и молекулярные функции. Вкратце, потери функции тестов: Если нокдаун производит фенотип, который может быть спасен, что эквивалентно, мутантом и WT мРНК, аллель, скорее всего, доброкачественные (зеленая коробка). Если мутант спасения нокдаун фенотип неотличимо от нокдауна фенотип, аллель является вероятным функциональных нулевым (квадрат желтого цвета). Если мутант спасения нокдаун фенотип является статистически лучше, чем MO, но хуже, чем WT, аллель может hypomorph (зеленая коробка) для доминирующей испытаний:. Если инъекции мРНК мутантного эквивалентно дикого типа мРНК , аллель может быть доброкачественными или потеря функции или анализа возможно, не удалось (зеленая коробка). Если инъекции мутантных мРНК INDIS tinguishable от нокдаун MO, функции генного продукта, вероятно, изменены в некотором роде. Чтобы различать изменение функции титровать мутант мРНК дикого типа мРНК. Если в результате этого титрование неотличима дикого типа мРНК только, мутантный белок продукт использует белок дикого типа в качестве субстрата, тем самым указывая доминантный негативный фенотип (синего цвета). Если в результате этого титрование неотличима к мутантным мРНК только, мутантный белок продукт больше не выполняет ту же функцию, как дикого типа, и, таким образом, вероятно, усиление функции (синего цвета). Если ни один фенотип не представляет из нокдаун MO, но действительно представляет с WT мРНК дальнейших экспериментов может произойти, WT мРНК человеческого следует титровать, чтобы минимизировать фенотип, а также может быть использован в качестве новой уставки. Далее инжекции из дикого типа и мутантного человеческого мРНК может быть оценена на основе спасения способность мутантного (розовый коробки).ET = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 2. Количественные и качественные оценки MKS1 мутации обнаружены в организме человека. Пороки развития в mks1 morphant эмбрионов. Зависимости от их важности, фенотипы были разделены на три группы. Примеры каждого класса представлены (а), и их распространенности в пределах их эмбрион когорты (п = 100-160 эмбрионов) в таблицу (не показана). MO вводят эмбрионы класса I фенотипа были грубо нормальную морфологию, но были короче, с чрезмерным эмбриональной ткани на желтке сравнению с контролем вводят эмбрионы в то же сомитного возраста (8-9 сомитами). Класс II морфанты были разбавленной, короткие и имели слабо развитая голова и хвост структур, и, кроме того не хватало сомитного определениюи симметрии. Класс III эмбрионы были сильно задерживается со слабо развитой и деформированные сомитах волнистого notochords, и, как правило, не выживают после 10 сомитов. Со-инъекции мРНК человеческого MKS1 спасен каждый из этих дефектов, демонстрируя специфичность фенотипов в mks1 подавления. В гибридизация эмбрионов на 11 сомитов (± 1 сомитов) окрашивали Krox20, pax2 и MyoD рибозонды (б, в ). Фенотипы были количественно путем измерения от первого до последнего заметный сегмент каждого эмбриона (стрелки), количественно с. Рисунок адаптировано с разрешения 15.
Рисунок 3. Примеры в естественных условиях моделирования человеческого дисморфологии. (А) черепно-лицевых дисморфологии. Управление мРНК вводят эмбрион (слева) и мутантных эмбрионов вводили (справа) окрашивали в синий Alcian 5 DPF. Мутанты мРНК впрыском эмбрионов отображения в частности малого и деформированные головки с общей дезорганизацией хрящевой скелет в том числе черепно-лицевых растопыренные жаберные дуги и пропавших без вести или неправильно структур. (B) Micro / макроцефалией. Управление uninjected эмбрион (слева) и kctd13 MO впрыском эмбриона (справа) на 5 DPF. Морфанты отображать расширение головы, как видно из пространства между глазами. 21 (C) Снижение целостности сосудов. Управление uninjected эмбриона (вверху) и ENG MO впрыском эмбриона (внизу) отображаемого использованием флуоресцентной микроскопии на 2 DPF в FLI1: УЗФБ трансгенной линии репортер. Морфанты отображения нарушениями межсегментарных прорастания сосудов и других сосудистых структур. 41 (D) Измененный цикл сердца. В гибридизация униnjected эмбрионов дикого типа (слева) показывают, СПАВ выражение в левой латеральной пластинки мезодермы, а ccdc39 morphant эмбрионов показала двустороннюю (справа) или, в большинстве случаев обнаружить выражение СПАВ (не показан). 43 (д) кисты почек. Uninjected WT эмбриона (вверху) и ift80 morphant (внизу). Морфанты отображаются большие кисты почки (стрелки), экссудативный отек (стрелка) и изогнутый хвост. 44 (F) снижение клубочковой фильтрации. Флуоресцентные визуализации управления вводят эмбрион (вверху) и ift80 morphant (внизу) через 24 ч после инъекции родамина декстран в сердце. Флуоресценция диспергирует в течение сосудистой системы и почти полностью эвакуировать почек, как видно полное отсутствие флуоресценции в контроле. Morphant отображает стойкие люминесцентные декстран, предполагая, пониженной клубочковой фильтрации. 46 (г) мышечной дистрофии. WT DNAJB6 мРН.А. вводят эмбрионы (вверху) показывает нормальную медленным мышечных волокон охватывающих сомитами обычно между соседними myosepta как определяется иммунным использованием анти-медленный миозин антитела. Мутант DNAJBb (внизу) показал частичной до полной отряд мышечных волокон от myosepta в одном или нескольких сомитами. 19 (H) Сегменты углом. Увеличенный живой боковым видом uninjected управления (вверху) или kif7 морфанты (внизу) отображаемого на 30 часов после оплодотворения. Морфанты отображать ненормально сомитами формы, связанные с внематочной Hedgehog сигнализации в миотомы данио 47.
Все цифры адаптирована с разрешения.
Discussion
Методы, описанные здесь, представляют собой общий протокол применимо к анализом несинонимичных изменения, связанные с разнообразием человеческих генетических заболеваний фенотипов (таблица 2, рисунок 3). Наши подходы доказали свою полезность для оценки потенциального воздействия на изменение фенотипа заболевания, а также помочь рассекают механизмов заболевания (например, вклад доминантной негативной мутации Барде-Бидля, в первую очередь аутосомно-рецессивные расстройства 17). На сегодняшний день через развитие представлено дерево принятия решений, мы смоделировали по разумной цене и времени, превышающего 200 генов причинно связаны с генетических нарушений, к избытку 1000 аллелей.
Хотя подробно не рассматриваются здесь, мы также показали, что эти методы являются подходящими для моделирования других типов генетических повреждений, таких как варианты количества копий (ВКК), а также и генетических взаимодействий. Анализ таких событий выходит за рамкинастоящем описании метода, хотя они принципиально полагаться на том же принципе систематического тестирования генов-кандидатов (включая пар генов вводят одновременно), чтобы определить индукции или обострения клинически соответствующие фенотипы. Например, чтобы выяснить, какие из 29 генов в 16p11.2 CNV могут иметь отношение к наблюдаемому Микроцефалия наблюдается у пациентов с дублированием 660 кб геномных сегментов, мРНК, соответствующей каждому из 29 генов в сегменте вводили и головы Размер измерения проводились при 2 и 5 DPF DPF, показывая крупным вкладом одной стенограммы, KCTD13. 21 Кроме того, мы использовали эту модель для анализа генетических взаимодействий геномных повреждений у пациентов как Барде-Бидля синдрома и болезни Гиршпрунга. +22 Путем сравнения MO подавление причинных генов из двух клинических тождества по отдельности и одновременно, мы смогли определить полученную фенотип как Beiнг синергическое взаимодействие, а не просто добавка тяжести.
Несмотря установив высокую чувствительность (98%) и специфичность (> 82%) для варианта способствующих цилиопатий 17, мы еще не имеют достаточных данных, чтобы определить, если они распространены на всех фенотипических показания у рыбок данио моделей. Для этого, большое количество аллелей, предсказанный генетически быть доброкачественными или патогенным, должны быть проверены в пределах каждого фенотипического категории. Это будет особенно важно для реализации таких анализов в клинических условиях, где функциональная интерпретация ВУСС можете сообщить диагностики и лечения только при наличии здоровой понимание ложных срабатываний и ложных негативов могут сопровождать поставку таких результатов для врачей и пациентов. Тем не менее, эти методы могут внести существенный вклад в сторону лучшего понимания ландшафта человеческих генетических заболеваний. Мы ожидаем, что эти модели будут не только служить осноdation для улучшения интерпретации клинических генетической информации, но также могут быть использованы в качестве полезных моделей проводить терапевтический экранов. В естественных данные также могут быть по сравнению с в кремнии вычислительные прогнозы из таких источников, как PolyPhen 23, плотные 24, ОНП-GO 25 или MutPred 26 показать согласования. Обратите внимание, что в предыдущем исследовании прогнозирования баз данных ОНП & GO и MutPred были признаны наиболее точными, с точностью составив лишь 0,82 и 0,81, соответственно. 27
Хотя мы наметили надежность этих методов для подмножества педиатрической анатомические дефекты (табл. 2, рис 3), некоторые фенотипы менее послушными с помощью этих методов. Некоторые исключения несмотря на это, существует три основных класса расстройства не поддаются нашему протоколу. Взрослом возрасте расстройств (таких как болезнь Паркинсона) представляют собой вызов модель в эмбриональных системы. Медленно прогression дегенеративных фенотипов (например, лобно-височная деменция), может потребоваться больше времени, чем семь окно денье активности MO производить фенотип. Другой ген нокдаун технологий, таких как RNAi и миРНК можно препятствовать или ухудшить гена-мишени, но было показано, что ни один из них, как конкретные, стабильные, нетоксичные, или длительным как МО 28, что также ограничивает срок для фенотипа. В-третьих, некоторые позвоночных структур, таких как млекопитающие легкие, не имеют достаточно ортологи структуры в данио эмбриона. Мы также предоставили предложил план действий в чрезвычайных для расследования этих дел, в которых человеку WT инъекции мРНК приводит к фенотипу, хотя мы предупреждаем, это необычная и нежелательные ситуации.
Некоторые фенотипа заболевания может затем требуют большей степенью абстракции и суррогатного материнства. Вполне возможно, что функции гена приводит к отклонению достаточно, чтобы ослабить фенотипического сходства между моделью и трие фенотип, или что данио физиологии сути усложняет эффектов индуцированного заболевания. В таких случаях мы предлагаем дальнейшее вскрытие производится фенотипа до увольнения. Мы подготовили несколько успешных примеров, в которых проблематично фенотипа для этого анализа были смоделированы у эмбрионов данио рерио. Например, мутации в TCF8, ген, связанный с Fuchs дистрофии роговицы (ГТД), анализировали с помощью нашего протокола с помощью гаструляции дефектов в качестве суррогатного фенотипических считывания на основе известной роли этого транскрипта в раннем развитии. 29 В других случаях такие как во взрослом возрасте мышечная дистрофия вызывается мутациями в DNAJB6, мы были способны генерировать мышечное волокно фенотипа в 5dpf эмбрионов, несмотря на то, что люди лишены заметных мышц патологии в первые три-четыре десятилетия жизни. 19
В дополнение к переходным мутант модели, представленные здесь, другие также принимают выгодноеGE этого переходного система для моделирования болезней человека в различных системах организма. В одном примере, пигментный ретинит был смоделирован в данио по нокдаун гена RP2, что приводит к гибели клеток сетчатки и снижение сетчатки ламинирования. Спасательные с человека дикого типа мРНК привело к развитию всех трех слоев сетчатки ламинирование, в то время как четыре из пяти мутант мРНК не удалось спасти. 30 Хотя эта модель человеческого сенсорных расстройств основан на морфологические фенотип, это также можно Анализ ответ на стимулы, такие как акустические испуга или предымпульсе торможения. 47
Недавно модель данио был использован для исследования болезни Альцгеймера патогенез через белка-предшественника амилоида. 31 Авторы показали, что ген нокдаун вызванных нарушением аксонный отросток двигательных нейронов, которые могут быть спасены с человеческой мРНК. Эта модель оказалась особенно информативны, как мышь модели отображают только тонкие phenotYpes (одного нокдауна) или послеродового летальности (двойной нокдаун). Способность оценить эмбрионов данио рерио в естественных условиях на протяжении развития помогли различить патогенный эффект уменьшения амилоидного белка-предшественника, а также при условии прямой доказательства того, что белок требует как внеклеточный и внутриклеточный домен для нормальной работы. Другие известные модели включают в себя, что дополнительные мышечные дистрофии 32, Diamond Blackfan анемии 33, Axenfeld Reiger-синдром (глаз и черепно-лицевого развития) 34, воспалительные заболевания кишечника 35 (антибактериальной активностью), болезнь Паркинсона 36 (нейрона и передвижения убыток) и захват 37 (гидроцефалия и гиперактивности).
Более распространенными являются мутантные линии данио, которые были показаны также перепросматривать фенотипа человека болезни. Отзыв в 1,38, модели включают лейкоз, меланома, дилатационная кардиомиопатия, мышечная дистрофия Дюшенна,и многие другие.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы признаем поддержку летних исследований Университета Дьюка Дина стипендия (), Американской ассоциации сердца (AHA) общение 11POST7160006 (CG), Национального института здоровья (NIH) гранты R01-EY021872 от глаз Национального института (EED), R01HD04260 от Национальный институт здоровья ребенка и развития (NK), R01DK072301 и R01DK075972 из Национального института диабета и пищеварительной почек (NK) и Европейского Союза (финансируется ЕС 7-й FP под GA Тел 241955, SYSCILIA проекта;. ЭЭИ, NK) NK является почетным Джин и Джордж Брамли профессор.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
| DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
| Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
| Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
| Equipment | |||
| PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
| Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
| AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
| DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
| DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
| Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements | ||
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Gerdes, J. M., Davis, E. E., Katsanis, N. The vertebrate primary cilium in development, homeostasis, and disease. Cell. 137, 32-45 (2009).
- Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N. Engl. J. Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J. Clin. Invest. 119, 428-437 (2009).
- Marion, V. Exome sequencing identifies mutations in LZTFL1, a BBSome and smoothened trafficking regulator, in a family with Bardet-Biedl syndrome with situs inversus and insertional polydactyly. J. Med. Genet. 49, 317-321 (2012).
- Otto, E. A. Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8 as the cause of a retinal-renal ciliopathy. Nat. Genet. 42, 840-850 (2010).
- Schaefer, E. Molecular diagnosis reveals genetic heterogeneity for the overlapping MKKS and BBS phenotypes. Eur. J. Med. Genet. 54, 157-160 (2011).
- Katsanis, N. The oligogenic properties of Bardet-Biedl syndrome. Hum. Mol. Genet. 13 Spec No 1, R65-R71 (2004).
- Badano, J. L. Dissection of epistasis in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Nature. 439, 326-330 (1038).
- Badano, J. L. Heterozygous mutations in BBS1, BBS2 and BBS6 have a potential epistatic effect on Bardet-Biedl patients with two mutations at a second BBS locus. Hum. Mol. Genet. 12, 1651-1659 (2003).
- Gerdes, J. M. Disruption of the basal body compromises proteasomal function and perturbs intracellular Wnt response. Nat. Genet. 39, 1350-1360 (2007).
- Leitch, C. C. Hypomorphic mutations in syndromic encephalocele genes are associated with Bardet-Biedl syndrome. Nat. Genet. 40, 443-448 (2008).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zaghloul, N. A., et al. Functional analyses of variants reveal a significant role for dominant negative and common alleles in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10602-10607 (2010).
- Davis, E. E. TTC21B contributes both causal and modifying alleles across the ciliopathy spectrum. Nat. Genet. 43, 189-196 (2011).
- Sarparanta, J., et al. Mutations affecting the cytoplasmic functions of the co-chaperone DNAJB6 cause limb-girdle muscular dystrophy. Nat. Genet. 44, 450-455 (2012).
- Selcen, D. Mutation in BAG3 causes severe dominant childhood muscular dystrophy. Annals of neurology. 65, 83-89 (2009).
- Golzio, C., et al. KCTD13 is a major driver of mirrored neuroanatomical phenotypes of the 16p11.2 copy number variant. Nature. 485, 363-367 (2012).
- de Pontual, L., et al. Epistasis between RET and BBS mutations modulates enteric innervation and causes syndromic Hirschsprung disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13921-13926 (2009).
- Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7, 248-249 (2010).
- Kumar, P., Henikoff, S., Ng, P. C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat. Protoc. 4, 1073-1081 (2009).
- Calabrese, R., Capriotti, E., Fariselli, P., Martelli, P. L., Casadio, R. Functional annotations improve the predictive score of human disease-related mutations in proteins. Hum. Mutat. 30, 1237-1244 (2009).
- Li, B., et al. Automated inference of molecular mechanisms of disease from amino acid substitutions. Bioinformatics. 25, 2744-2750 (2009).
- Thusberg, J., Olatubosun, A., Vihinen, M. Performance of mutation pathogenicity prediction methods on missense variants. Hum. Mutat. 32, 358-368 (2011).
- Summerton, J. E. Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity. Curr. Top. Med. Chem. 7, 651-660 (2007).
- Riazuddin, S. A., et al. Missense mutations in TCF8 cause late-onset Fuchs corneal dystrophy and interact with FCD4 on chromosome 9p. Am. J. Hum. Genet. 86, 45-53 (2010).
- Shu, X., et al. Knockdown of the zebrafish ortholog of the retinitis pigmentosa 2 (RP2) gene results in retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 2960-2966 (2011).
- Song, P., Pimplikar, S. W. Knockdown of amyloid precursor protein in zebrafish causes defects in motor axon outgrowth. PloS one. 7, e34209 (2012).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, 623-633 (2010).
- Danilova, N., Sakamoto, K. M., Lin, S. Ribosomal protein S19 deficiency in zebrafish leads to developmental abnormalities and defective erythropoiesis through activation of p53 protein family. Blood. 112, 5228-5237 (2008).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D. S., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of axenfeld-rieger syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 7-22 (2012).
- Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4, 832-841 (2011).
- Sheng, D., et al. Deletion of the WD40 domain of LRRK2 in Zebrafish causes Parkinsonism-like loss of neurons and locomotive defect. PLoS genetics. 6, e1000914 (2010).
- Teng, Y., et al. Loss of zebrafish lgi1b leads to hydrocephalus and sensitization to pentylenetetrazol induced seizure-like behavior. PloS one. 6, e24596 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods Cell Biol. 76, 415-436 (2004).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
- Lee, N. Y. Endoglin regulates PI3-kinase/Akt trafficking and signaling to alter endothelial capillary stability during angiogenesis. Molecular Biology of the Cell. 23, 2412-2423 (2012).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 228, 30-40 (2003).
- Merveille, A. C., et al. CCDC39 is required for assembly of inner dynein arms and the dynein regulatory complex and for normal ciliary motility in humans and dogs. Nat. Genet. 43, 72-78 (2011).
- Beales, P. L. IFT80, which encodes a conserved intraflagellar transport protein, is mutated in Jeune asphyxiating thoracic dystrophy. Nat. Genet. 39, 727-729 (2007).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr. Nephrol. 23, 2095-2099 (2008).
- Putoux, A. KIF7 mutations cause fetal hydrolethalus and acrocallosal syndromes. Nat. Genet. 43, 601-606 (2011).
