Här presenterar vi en systematisk metod för att utveckla fysiologiskt relevant, känslig och specifik<em> In vivo</em> Analyser för att tolka variationer i människans patologi. Övergående genetisk manipulation via mikroinjektion av WT och muterade humana mRNA och morfolino (MO) antisensoligonukleotider utnyttja spårbarhet av utvecklingsländerna zebrafisk embryot att snabbt mutationer assay patogena, särskilt, men inte uteslutande, i samband med mänskliga utvecklingsstörningar.
Här presenterar vi metoder för utveckling av testmetoder för att Query potentiellt kliniskt signifikanta nonsynonymous ändringar med hjälp av in vivo komplettering i zebrafisk. Zebrafisk (Danio rerio) är ett användbart djur-system på grund av sin experimentella överskådlighet, embryon är transparenta för att möjliggöra enkel visning, genomgår snabba vivo utveckling ex, och kan vara genetiskt manipulerade 1 Dessa aspekter har möjliggjort betydande framsteg i analysen av fosterutvecklingen,. molekylära processer och morphogenetic signalering. Sammantaget fördelarna med denna ryggradsdjur modell gör zebrafisk mycket mottaglig för modellering av utvecklings-hoppar i pediatrisk sjukdom, och i vissa fall, vuxen-debut störningar. Eftersom zebrafisk genomet är mycket konserverad med den hos människor (~ 70% ortolog), är det möjligt att rekapitulera humana sjukdomstillstånd i zebrafisk. Detta åstadkoms antingen genom injektion av mutant human MRNA för att inducera dominant negativ eller förstärkning av funktionen alleler, eller utnyttjande av morfolinogrupper (MO) antisensoligonukleotider att undertrycka gener att efterlikna förlorad funktion varianter. Genom komplettering av MO-inducerad fenotyper med utjämnade human mRNA, gör vår strategi tolkning av den skadliga effekten av mutationer på humant protein sekvens baserad på förmågan hos mutant mRNA för att rädda en mätbar, fysiologiskt relevant fenotyp. Modellering av den mänskliga sjukdomen alleler sker genom mikroinjektion av zebrafisk embryon med MO och / eller humant mRNA vid 1-4 cellstadiet och fenotypning upp till sju dagar efter befruktningen (DPF). Denna allmänna strategi kan utvidgas till ett brett spektrum av sjukdomstillstånd fenotyper, vilket visas i följande protokoll. Vi presenterar våra etablerade modeller för morphogenetic signalering, kraniofaciala, hjärt-, kärl-integritet, njurfunktion och skelettmuskulaturen fenotyper sjukdom, liksom andra.
Den funktionella tolkningen av genetisk information och tilldelning av det prediktiva kliniska värdet till en genotyp utgör ett stort problem i medicinsk genetik och blir alltmer gripande med den allt snabbare tekniska och ekonomiska genomförbarheten av genomet hela sekvensering. Därför är det nödvändigt att utveckla och implementera nya paradigm för att testa sjukdomsframkallande varianter av okänd betydelse (VUS) upptäcktes hos patienter. Dessa analyser måste då vara korrekt, tid-och kostnadseffektivt, och hamnen potential att katalysera en övergång till klinisk användbarhet.
Även musen har traditionellt verktyget för val när det gäller mänskliga sjukdomar modellering är zebrafisk fram som ett vetenskapligt och ekonomiskt gynnsamt surrogat. Till skillnad från musen, låter zebrafisk biologi enkel och snabb tillgång till alla utvecklingsstadier, med hjälp av optisk klarhet embryon som möjliggör realtid avbildning av utvecklingsländernas sjukdomar. <sup> 1 Den relativt nya generationen mutantzebrafish linjer har gett ytterligare tester och alternativ modellering, anställd av många i funktionella studier, men denna teknik fortsätter att vara begränsad (granskas 1,38). Inte bara är genetiska mutanter med knock-ins för specifika mutationer besvärligt att uppnå, de är också inte mottaglig för medelhög eller hög genomströmning analys för testning av ett antal mutationer i en enda gen. Viktigt kan en enda serie test ger information inte bara för den patogena potential alleler, utan också för inriktningen av effekten på cellnivå (t ex förlust av funktion kontra vinst av funktion), vilket är avgörande för att informera läget av arv i familjer, i synnerhet när små mänskliga stamtavlor hyser begränsad information om läget av genetisk överföring. För ytterligare jämförelse av användningen av tillgängliga mus och modeller zebrafisk, se tabell 1.
Vi noterar också attre är inneboende begränsningar till zebrafisk modellsystem. Även D. rerio ha snabb inledande utvecklingen av organsystem, kräver könsmognad cirka tre månader. På grund av detta, prenatal och pediatrisk-starten störningar är de mest lämpade för detta övergående uttryck modell. Även idealisk för att genomföra stora skärmar kemisk förening, är användningen av genetiska mutanter inte möjligt för systematisk testning av tusentals nonsynonymous varianter som bidrar till, och fortsätta att detekteras i pediatriska sjukdomar.
Kompletteringen testerna beskrivs här dra nytta av detta experimentella lätthanterlighet hög grad av homologi, och bevarande av funktion mellan mänskliga och zebrafisk proteiner, i synnerhet så för molekyler som är nödvändiga för bevarade utvecklingsprocesser. Figur 1 en översikt över testning och identifiering strategi för olika allel effekter. Både förlust av funktion (LOF) och dominerande analyser kan utföras. För LOF, börjar experimentera med undertryckandet av genen av intresse med en morfolino knockdown och analysera för fenotyper som kan vara relevanta för den kliniska fenotypen under utredning. Suppression kan uppnås antingen genom att blockera translation genom att rikta en MO vid eller nära det translationella startstället för zebrafisk lokuset (översättning blockerare morfolino; tbMO) eller genom att interferera med splitsning genom att placera en MO den en splitsningsförbindelse, typiskt inducera antingen ta upp ett intron eller avvikande exon hoppa (skarven blockering morfolino; SBMO).
Därefter utjämnade mRNA från ortologa mänskliga avskriften introduceras och kvantifierbara räddning av fenotypen mäts. När analysen är etablerad kan kandidat-mutationer i det mänskliga budskapet införas och analyserades med avseende på deras förmåga att rädda den MO-inducerade fenotypen vid samma effektivitet som WT humant mRNA. Omvänt, för kandidat dominanta alleler, human mRNA (men inte MO) är inföed med en förväntan om att WT human mRNA inte grovt påverkar zebrafisk anatomi och fysiologi, medan införandet av test mutationer som har en dominerande effekten kommer att framkalla fenotyper analoga med dem som observerats i humana kliniska tillstånd. Detta experiment kan vara finkornig vidare att dissekera huruvida den dominerande effekten sker genom en förstärkning av funktion (GOF) eller en dominant-negativ mekanism genom att blanda WT och muterade humana mRNA, för GOF evenemang, tillsats av WT human mRNA förväntas vara irrelevant, bör medan för dominant-negativa alleler, blandning av WT och muterade mRNA ändra svårighetsgrad fenotypen inducerad av mutant budskap. I samtliga fall rekommenderar vi att alla kombinationer av injektioner (MO med WT human mRNA vs morfolino med mutant human mRNA etc. utföras, helst inom samma koppling av embryon (se figur 1) Tolkning är enligt följande.:
För LOF tester:
För dominerande tester:
Beredskapsplan:
De metoder som beskrivs här ett allmänt protokoll tillämpas på analysen enligt nonsynonymous förändringar i samband med ett flertal humana genetiska sjukdomar fenotyper (tabell 2, figur 3). Våra metoder har visat sig användbara för att utvärdera den potentiella inverkan av variation på sjukdom fenotyper, samt att hjälpa till att dissekera sjukdomsmekanismerna (t.ex. bidrag dominanta negativa mutationer till Bardet-Biedl syndrom, en huvudsakligen autosomalt recessiv sjukdom 17). Hittills genom utveckling av det presenterade beslutet trädet, har vi modellerat till en rimlig kostnad och tid som överstiger 200 gener kausalt samband med genetiska sjukdomar, till ett överskott på 1.000 alleler.
Även om det inte diskuteras i detalj här, har vi även visat att dessa metoder är lämpliga för att modellera andra typer av genetiska lesioner, såsom copy number variants (CNVs) samt och genetiska interaktioner. Analyser av sådana händelser är utanför ramen förden nuvarande metoden beskrivningen, även om de i grunden är beroende av samma princip om systematisk testning av kandidatgener (inklusive par av gener injiceras samtidigt) för att bestämma induktion eller förvärrande av kliniskt relevanta fenotyper. Till exempel kan belysa vilka av de 29 generna i 16p11.2 CNV vara relevanta för den observerade mikrocefali observerats hos patienter med upprepningar av en 660 kb genomisk segment, mRNA som motsvarar varje av de 29 generna inom segmentet injicerades och huvud storlek Mätningarna utfördes vid 2 dpf och 5 DPF, avslöjar ett viktigt bidrag för ett enda transkript, KCTD13. Dessutom 21 har vi använt denna modell för analys av genetiska interaktioner av genomiska lesioner hos patienter med både BARDET-Biedl syndrom och Hirschsprung sjukdom. 22 Genom jämförelse av MO undertryckande av de kausala gener från de två kliniska identiteter separat och samtidigt, kunde vi identifiera den resulterande fenotypen som being en synergistisk interaktion snarare än enbart additiv svårighetsgrad.
Trots att ha etablerat hög sensitivitet (98%) och specificitet (> 82%) för varianter som bidrar till ciliopathies 17, har vi ännu inte har tillräckliga uppgifter för att avgöra om dessa är generaliserbara till alla fenotypiska avläsning i zebrafisk modeller. För att göra detta, förutspådde ett stort antal alleler, genetiskt att vara antingen godartad eller patogena, måste provas inom varje fenotypisk kategori. Detta kommer att vara särskilt viktigt för genomförandet av sådana analyser i den kliniska inställningen, kan vilken funktionell tolkning av VUSs informera diagnos och behandling endast om en robust förståelse för falska positiva och falska negativa kan medfölja leveransen av sådana resultat för läkare och patienter. Ändå kan dessa metoder bidra avsevärt mot en bättre förståelse av landskapet av mänsklig genetisk sjukdom. Vi räknar med att dessa modeller inte bara kommer att fungera som ett stiftelsertion för förbättrad tolkning av klinisk genetisk information, men också kommer att anställas som användbara modeller för att genomföra terapeutiska skärmar. in vivo-data även kan jämföras med i silico computational förutsägelser från källor som PolyPhen 23, sikta 24, MutPred SNP & GO 25, eller 26 att visa numren. Observera att i en tidigare studie av förutsägelse databaser SNP & GO och MutPred befanns vara den mest exakta, med noggrannhet når bara 0,82 och 0,81, respektive. 27
Även om vi har beskrivit robustheten av dessa metoder för en delmängd av pediatriska anatomiska defekter (tabell 2, figur 3), vissa fenotyper är mindre lätthanterliga med dessa metoder. Vissa undantag trots, det finns tre huvudsakliga typer av sjukdomar inte mottagliga för våra protokoll. Vuxen ålder störningar (såsom Parkinsons sjukdom) utgör en utmaning för modellen i en embryonal systemet. Långsam progression degenerativa fenotyper (t.ex. frontotemporal demens) kan kräva mer tid än de sju dpf fönster MO aktivitet för att producera en fenotyp. Andra gen knockdown teknik såsom RNAi och siRNA finns att störa eller försämra genen mål, men det har visat sig att ingen är så specifika, stabil, icke-toxisk, eller långvarig som MOS 28, vilket också begränsar tidsramen för fenotypning. Tredje, har vissa ryggradsdjur strukturer, såsom däggdjur lungan, inte en tillräckligt ortologa struktur i zebrafisk embryot. Vi har också ett förslag beredskapsplan för utredning av sådana fall där WT human mRNA injektion leder till en fenotyp, men vi varnar för att detta är en ovanlig och oönskad situation.
Vissa sjukdomar fenotyper kan då kräva en högre grad av abstraktion och surrogatmoderskap. Det är möjligt att genfunktion har avvikit tillräckligt för att försvaga den fenotypiska likhet mellan modell och true fenotyp, eller att zebrafisk fysiologi komplicerar inneboende effekterna av inducerad sjukdom. I sådana fall föreslår vi ytterligare dissektion av den producerade fenotypen före avsättning. Vi har producerat några lyckade exempel där problematiska fenotyper för denna analys har modellerats i zebrafisk embryon. Till exempel, mutationer i TCF8 var en gen associerad med Fuchs corneal dystrofi (FCD), analyseras med hjälp av våra protokoll med hjälp Gastrulation defekter som ett surrogat fenotypisk avläsning utifrån kända roller i detta transkript i tidig utveckling. 29 I andra fall, t.ex. som vuxen ålder muskeldystrofi orsakas av mutationer i DNAJB6, kunde vi generera myofiber fenotyper i 5dpf embryon trots att människan är berövad märkbar muskel patologi i sina första tre till fyra decennier av liv. 19
Förutom de transienta muterade modellerna som presenteras här, har andra tagit även fördelaktigaGE i denna övergående system för att modellera människans sjukdomar i olika organ system. I ett exempel, var retinitis pigmentosa modelleras i zebrafisk av knockdown av genen RP2, vilket resulterar i retinal celldöd och minskad retinal laminering. Rescue med humant vildtyp mRNA resulterade i utvecklingen av alla tre skikten av retinal laminering, medan fyra av fem mutanta mRNA misslyckats med att rädda. 30 Även om denna modell av ett mänskligt sensorisk störning är baserad på en morfologisk fenotyp, är det också möjligt att assay svar på stimuli såsom akustisk skrämma eller prepulse inhibition. 47
Nyligen var en zebrafisk modell som används för att undersöka Alzheimers sjukdom patogenes genom amyloidprekursorprotein. 31 Författarna visade att genen knockdown orsakade nedsatt axonutväxt av motoriska nervceller, som skulle kunna räddas med humant mRNA. Denna modell har visat sig vara speciellt informativ, eftersom musmodeller bara visa subtila phenotypes (enda knockdown) eller postnatal dödlighet (dubbel knockdown). Förmågan att utvärdera zebrafisk embryon in vivo genom hela utvecklingen bidragit till att urskilja den patogena effekten av reducerad amyloidprekursorproteinet, samt förutsatt direkta bevis att proteinet kräver både en extracellulär och intracellulär domän för fullgod funktion. Andra noterbara modeller inkluderar att ytterligare muskeldystrofi 32, Diamond Blackfan anemi 33, Axenfeld-Reiger syndrom (okulär och kraniofaciala utveckling) 34, inflammatorisk tarmsjukdom 35 (antibakteriell aktivitet), Parkinsons sjukdom 36 (neuron och locomotion förlust), och beslag 37 (hydrocefalus och hyperaktivitet).
Vanligare är mutantzebrafish linjer som har visat också att rekapitulera en mänsklig sjukdom fenotyp. Kommenterad av 1,38, modeller inkluderar leukemi, melanom, dilaterade kardiomyopati, Duchennes muskeldystrofi,och många andra.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stöd från en Duke University Dean Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) gemenskap 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) bidrag R01-EY021872 från National Eye Institute (EED), R01HD04260 från National Institute of Child Health and Development (NK), R01DK072301 och R01DK075972 från National Institute of Diabetes Digestive och njurpåverkan (NK), och Europeiska unionen (Finansierat av EU 7: e ramprogrammet enligt GA nr 241.955, projekt SYSCILIA,. EED, NK) NK är en Distinguished Jean och George W. Brumley Professor.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |