Her presenterer vi en systematisk tilnærming for å utvikle fysiologisk relevant, sensitiv og spesifikk<em> In vivo</em> Analyser for å tolke variasjon i menneskelig patologi. Transient genetisk manipulering via mikroinjeksjon av WT og mutert human mRNA og morfolino (MO) antisens oligonukleotider utnytte tractability av utviklingen av zebrafisk embryo hurtig assay patogene mutasjoner, spesielt, men ikke utelukkende, i forbindelse med humane utviklingsforstyrrelser.
Her presenterer vi metoder for utvikling av metoder for å Query potensielt klinisk signifikante nonsynonymous endringer ved hjelp av in vivo complementation i sebrafisk. Sebrafisk (Danio rerio) er et nyttig dyr system på grunn av sin eksperimentelle tractability; embryo er gjennomsiktig slik at lettvinte visning, gjennomgår rask utvikling ex vivo, og kan være genetisk manipulert 1 Disse aspektene har tillatt for betydelige fremskritt i analysen av embryogenesen. molekylære prosesser, og morfogenetiske signalanlegg. Til sammen fordelene ved denne virveldyr modell gjør sebrafisk svært mottagelig for modellering av utviklingsmessige defekter i pediatrisk sykdom, og i noen tilfeller, voksen-utbruddet lidelser. Fordi zebrafisk genomet er svært konservert med den hos mennesker (~ 70% ortologe), er det mulig å repetere humane sykdomstilstander i zebrafisk. Dette skjer enten ved injeksjon av mutant human mRNA for å indusere dominant negativ eller forsterkning av funksjons alleler, eller utnyttelse av morfolino (MO) antisens oligonukleotider for å undertrykke gener for å etterligne tap av funksjon varianter. Gjennom complementation av MO-induserte fenotyper med avkortet menneskelig mRNA, gjør vår tilnærming tolkningen av den skadelige effekten av mutasjoner på menneskelig protein sekvens basert på evnen til mutant mRNA å redde en målbar, fysiologisk relevant fenotype. Modellering av menneskelig sykdom alleler skjer gjennom mikroinjeksjon av sebrafisk embryoer med MO og / eller menneskelig mRNA på 1-4 celle scenen, og phenotyping opp til syv dager etter befruktning (DPF). Denne generelle strategi kan bli utvidet til et bredt spekter av sykdomstilstander fenotyper, som vist i den følgende protokoll. Vi presenterer våre etablerte modeller for morfogenetiske signalering, craniofacial, hjerte-, kar integritet, nyrefunksjon, og muskelavslappende lidelse fenotyper, så vel som andre.
Den funksjonelle tolkningen av genetisk informasjon og tildeling av prediktiv klinisk verdi til en genotype representerer et stort problem i medisinsk genetikk og blir stadig mer intens med akselererende teknisk og økonomisk gjennomførbarhet av genom-wide sekvensering. Derfor er det nødvendig å utvikle og implementere nye paradigmer for å teste pathogenicity varianter av ukjent betydning (VUS) oppdaget hos pasienter. Disse analysene må da være nøyaktig, tids-og kostnadseffektiv, og havnen potensial til å katalysere en overgang til klinisk nytte.
Mens musen har vært tradisjonelt førstevalget innen menneskelig sykdom modellering, er sebrafisk fremstår som en vitenskapelig og økonomisk gunstig surrogat. I motsetning til mus, gjør sebrafisk biologi enkel og rask tilgang til alle utviklingsstadier, hjulpet av optisk klarhet av embryoer som gir real-time imaging for å utvikle sykdommer. <sup> 1 Den relativt ny generasjon av mutant sebrafisk linjer har gitt ytterligere testing og modellering alternativer, ansatt av mange i funksjonelle studier, men denne teknologien fortsetter å være begrenset (anmeldt i 1,38). Ikke bare er genetiske mutanter med knock-ins av spesifikke mutasjoner arbeidskrevende å oppnå, er de heller ikke mottagelig for middels eller høy-throughput analyser for testing av en rekke mutasjoner i et enkelt gen. Viktigere, kan en enkelt pakke med tester gi informasjon ikke bare for patogene potensial alleler, men også for i hvilken retning på cellenivå (f.eks tap av funksjon vs gevinst på funksjon), som er avgjørende for å informere arvegangen i familier, spesielt når små menneskelige stamtavler havna begrenset informasjon om modusen for genetisk overføring. For ytterligere sammenligning av bruken av tilgjengelig mus og sebrafisk modeller, se tabell 1.
Vi merker oss også atre er iboende begrensninger i sebrafisk-modellen system. Selv D. rerio har rask første utviklingen av organsystemer, krever seksuell modenhet lag tre måneder. På grunn av dette, prenatal og barn-utbruddet lidelser er den mest mottagelig for dette forbigående uttrykk modell. Mens ideelt for gjennomføring av store kjemisk forbindelse skjermer, er bruk av genetiske mutanter ikke gjennomførbart for systematisk testing av tusener av nonsynonymous varianter som bidrar til, og fortsetter å bli påvist i pediatriske lidelser.
De complementation testene som er beskrevet her dra nytte av denne eksperimentelle tractability, høy grad av homologi, og bevaring av funksjon mellom menneskelige og sebrafisk proteiner, spesielt så for molekyler som er nødvendige for konserverte utviklingsprosesser. Figur 1 skisserer testing og identifikasjon strategi for ulike allel effekter. Begge tap av funksjon (LOF) og dominante assayer kan utføres. For LOF begynner eksperimentere med undertrykkelse av genet av interesse med en morfolinogruppe knockdown, og analysering for fenotyper som kan være relevante for den kliniske fenotypen under etterforskning. Undertrykkelse kan oppnås enten ved å blokkere oversettelse ved å målrette en MO ved eller nær den translasjonelle start området av zebrafisk-locus (oversettelse blokkering morfolino; tbMO) eller ved å interferere med skjøting ved å plassere en MO den spleisetapen knutepunkt, typisk indusere enten inkludering av en intron eller avvikende ekson hoppe (spleise blokkering morpholino; sbMO).
Deretter blir avkortet mRNA fra ortologe menneskelige transkripsjon innført og kvantifiserbare redning av fenotypen måles. Når analysen ble etablert, kan kandidat-mutasjoner i menneskelig innhold innføres og analysert for deres evne til å redde MO-induserte fenotype ved samme effektivitet som WT human mRNA. Omvendt, for kandidat dominant allel, humant mRNA (men ikke MO) er innføed med en forventning om at WT menneskelig mRNA ikke vil grovt påvirke sebrafisk anatomi og fysiologi, mens innføring av test mutasjoner som har en dominerende innvirkning vil indusere fenotyper analoge med de som ble observert i kliniske tilstand. Dette eksperimentet kan være finkornet ytterligere å dissekere om den dominerende effekten oppstår av en gevinst på funksjon (GOF) eller en dominant-negative mekanismen ved å blande WT og mutant menneskelig mRNA, for GOF hendelser, tillegg av WT menneskelig mRNA er forventet å være irrelevant, bør mens for dominant-negative alleler, blanding av WT og mutante mRNA forandre graden av fenotypen indusert av mutant-melding. I alle tilfeller anbefales det at alle kombinasjoner av injeksjoner (MO med WT humant mRNA g. morpholino med mutant human mRNA etc. kan utføres, fortrinnsvis i løpet av den samme kopling av befruktede egg (se figur 1) Tolkning er som følger.:
For LOF tester:
For dominerende tester:
Beredskapsplan:
Metodene som beskrives her, representerer en generell protokoll som gjelder for analysen av nonsynonymous forandringer assosiert med en rekke genetiske sykdommer fenotyper (tabell 2, figur 3). Våre tilnærminger har vist seg nyttig å evaluere den potensielle virkningen av variasjon på sykdom fenotyper, og bidra til å dissekere sykdomsmekanismer (for eksempel bidrag av dominerende negative mutasjoner til Bardet-Biedl syndrom, en primært autosomal recessiv lidelse 17). Hittil gjennom utviklingen av den fremlagte beslutningstre, har vi formet til rimelig pris og tid av over 200 gener kausalt forbundet med genetiske lidelser, til et overskudd av 1000 alleler.
Selv om det ikke diskutert i detalj her, har vi også vist at disse metodene er hensiktsmessig å modellere andre typer genetiske lesjoner, for eksempel kopi nummer varianter (CNVs) samt og genetiske interaksjoner. Analyser av slike hendelser er utenfor rammen avden foreliggende fremgangsmåte beskrivelse, selv om de er fundamentalt avhengig av det samme prinsipp for systematisk testing av kandidat gener (inkludert parene av gener injisert samtidig) for å bestemme induksjonen eller forverring av klinisk aktuelle fenotyper. For eksempel kan for å belyse hvilken av de 29 gener i 16p11.2 CNV være relevant for den observerte microcephaly observert hos pasienter med duplikasjoner av et 660 kb genomisk segment, mRNA som tilsvarer hver av de 29 gener i segmentet ble injisert og hode størrelse målinger ble utført ved to DPF og fem DPF, avslører et stort bidrag av en enkelt avskrift, KCTD13. 21. I tillegg har vi brukt denne modellen til analysen genetiske interaksjoner av genomisk lesjoner hos pasienter med både Bardet-Biedl syndrom og Hirschsprung sykdom. 22. Ved sammenligning av MO undertrykkelse av de kausale gener av de to kliniske identiteter hver for seg og samtidig, var vi i stand til å identifisere de resulterende fenotype som being en synergistisk interaksjon heller enn bare additiv alvorlighetsgrad.
Til tross for å ha etablert høy sensitivitet (98%) og spesifisitet (> 82%) for variantene bidrar til ciliopathies 17, vet vi ennå ikke har tilstrekkelige data for å fastslå om disse er generell nytteverdi for alle fenotypiske readouts i sebrafisk modeller. For å gjøre dette, forutsa et stort antall alleler, genetisk å være enten benigne eller patogene, må prøves i hvert fenotypisk kategori. Dette vil være spesielt viktig for gjennomføringen av slike analyser i klinisk setting, kan der funksjonell tolkning av VUSs informere diagnostisering og behandling bare hvis en robust forståelse av falske positive og falske negative kan følge med levering av slike resultater til leger og pasienter. Likevel kan disse metodene bidra betydelig mot en bedre forståelse av landskapet av menneskelig genetisk sykdom. Vi forventer at disse modellene ikke bare vil tjene som et grunnlaget for en bedre tolkning av klinisk genetisk informasjon, men vil også bli benyttet som nyttige modeller for å gjennomføre terapeutiske skjermer. In vivo data kan også være i forhold til i silico beregningsorientert spådommer fra kilder som PolyPhen 23, sile 24, MutPred SNPs & GO 25, eller 26 vise konkordans. Merk at i en tidligere studie av prediksjon databaser SNPs & GO og MutPred ble funnet å være den mest nøyaktige, med nøyaktighet nå bare 0,82 og 0,81, henholdsvis. 27.
Selv om vi har beskrevet robustheten av disse metodene for et delsett av pediatriske anatomiske defekter (tabell 2, figur 3), visse fenotyper er mindre medgjørlig ved disse metodene. Noen unntak til tross, det er tre hovedklasser av lidelser ikke mottagelig for protokollen vår. Voksen-utbruddet lidelser (for eksempel Parkinsons sykdom) representerer en utfordring å modellere i en embryonale system. Sakte progression degenerative fenotyper (slik som frontotemporal demens) kan kreve mer tid enn de syv dpf vindu av MO aktivitet for å produsere en fenotype. Andre genet knockdown teknologier som RNAi siRNA og er tilgjengelige for å forstyrre eller forringe genet målet, men det har vist seg at ingen er så bestemt, stabil, ikke-giftig, eller langvarig som MOS 28, og dermed også begrenser tidsramme for phenotyping. Det tredje vil enkelte virveldyr strukturer, slik som hos pattedyr lunge, ikke ha en tilstrekkelig ortologe struktur i zebrafisk embryo. Vi har også gitt et forslag til beredskapsplan for etterforskningen av de tilfeller der WT menneskelig mRNA injeksjon fører til en fenotype, selv om vi advare dette er en uvanlig og uønsket situasjon.
Visse sykdommer fenotyper kan da kreve en større grad av abstraksjon og surrogacy. Det er mulig at gen-funksjon har avvek tilstrekkelig til å svekke fenotypisk likhet mellom modell og true fenotype, eller at zebrafisk fysiologi kompliserer iboende virkningen av indusert sykdom. I slike tilfeller foreslår vi videre disseksjon av det produserte fenotype før oppsigelse. Vi har produsert noen vellykkede eksempler der problematiske fenotyper for denne analysen har blitt modellert i sebrafisk embryoer. For eksempel mutasjoner i TCF8, ble et gen assosiert med Fuchs korneadystrofi (FCD), som ble analysert ved hjelp av vår protokoll ved å bruke gastrulation defekter som et surrogat fenotypisk avlesning bakgrunn av den kjente rollene til dette transkript i tidlig utvikling. 29. I andre tilfeller, f.eks som voksen-utbruddet muskeldystrofi skyldes mutasjoner i DNAJB6, var vi i stand til å generere myofiber fenotyper i 5dpf embryoer til tross for det faktum at mennesker er blottet for merkbar muskel patologi i sine første tre-fire tiår av livet. 19.
I tillegg til de forbigående mutant modellene som presenteres her, andre har også tatt BELIGGEge av denne forbigående system for å modellere sykdom hos mennesker i en rekke systemer i kroppen. I ett eksempel ble retinitis pigmentosa modellert i zebrafisk ved knockdown av genet RP2, som resulterer i celledød retinal og redusert retinal laminering. Rescue med human villtype mRNA resultert i utviklingen av alle tre lag med retinal laminering, mens fire av fem mutante mRNA unnlatt å redde. 30. Selv om denne modell av et humant sensorisk forstyrrelse er basert på en morfologisk fenotype, er det også mulig å analysen svar på stimuli som akustisk skremmeeffekt eller prepulse hemming. 47.
Nylig ble en sebrafisk-modellen brukes til å undersøke Alzheimers sykdom patogenesen gjennom amyloidforløperprotein. 31 Forfatterne viste at genet knockdown forårsaket nedsatt aksonal utvekst av motoriske nerveceller, som kunne bli reddet med menneskelig mRNA. Denne modellen har vist seg å være spesielt informativ, som musemodeller bare vise subtil phenotypes (single knockdown) eller postnatal Dødelighet (dobbel knockdown). Evnen til å evaluere sebrafisk embryoer in vivo gjennom hele utviklingen bidratt til å skjelne den patogene effekt av redusert amyloidforløperprotein, samt gitt direkte bevis for at proteinet krever både en ekstracellulær og intracellulær domene for riktig funksjon. Andre kjente modeller inkluderer at ekstra muskeldystrofier 32, Diamond Blackfan 33 anemi, Axenfeld-Reiger syndrom (okulære og kraniofacial utvikling) 34, inflammatorisk tarmsykdom 35 (antibakteriell aktivitet), Parkinsons sykdom 36 (nevroner og bevegelsesevne tap), og beslag 37 (hydrocephalus og hyperaktivitet).
Mer vanlig er mutant sebrafisk linjer som har vist seg også å rekapitulere en menneskelig sykdom fenotype. Gjennomgått i 1,38, modellene inkluderer leukemi, melanom, utvidede kardiomyopati, Duchenne muskeldystrofi,og mange andre.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner støtte fra en Duke University Dean Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) fellesskap 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01-EY021872 fra National Eye Institute (EED), R01HD04260 fra National Institute of Child Health and Development (NK), R01DK072301 og R01DK075972 fra National Institute of Diabetes Digestive og nyre lidelser (NK), og Den europeiske union (Finansiert av EU 7. FP henhold GA nr 241955, prosjekt SYSCILIA;. EED, NK) NK er en Distinguished Jean og George W. Brumley professor.
Reagent | |||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S, M0530L | |
DpnI restriction endonuclease | NEB | R0176L, R0176S | |
Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258-012 | |
Big Dye Terminator | Applied Biosystems | 4337455 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Invitrogen | AM1340, AM1344, AM1348 | |
Morpholino | Gene-Tools | n/a | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | Prepare as 0.003% PTU in embryo media |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4% |
Tricaine methane sulfonate | Western Chemical | N/A | For anesthetization and euthanasia |
Equipment | |||
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler | BioRad | Any equivalent thermal cycler | |
Nano Drop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
SMZ 745T Stereomicroscope | Nikon | ||
AZ100 Stereomicroscope | Nikon | ||
DS Fi1 Digital Camera | Nikon | For color/fluorescent imaging | |
DS QiMC Digital Camera | Nikon | For black/white imaging | |
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software | NIS- Elements |