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Immunology and Infection

की मौखिक संचरण Published: May 6, 2013 doi: 10.3791/50381
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

यह कागज का उपयोग कर चूहों के मौखिक संक्रमण के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन

Abstract

एल monocytogenes मानव में खाद्य जनित संक्रमण का कारण है कि ऐच्छिक इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ों हैं. बहुत कम निकट मानव रोग mimics कि एक छोटे पशु मॉडल की कमी के कारण listeriosis की जठरांत्र चरण के बारे में जाना जाता है. इस पत्र एल के मौखिक संचरण के लिए एक उपन्यास माउस मॉडल का वर्णन monocytogenes. चूहों खिलाया एल, इस मॉडल का उपयोग monocytogenes-दूषित रोटी अतिसंवेदनशील (BALB / ग / जम्मू द्वारा /) या प्रतिरोधी (C57BL / 6) माउस उपभेदों में प्रणालीगत प्रसार की डिग्री बदलती द्वारा पीछा गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण का एक असतत चरण में है. संक्रमण के बाद के चरणों के दौरान, पित्ताशय और मस्तिष्क के लिए प्रसार में मनाया जाता है. listeriosis के भोजन जनित मॉडल, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है विशेष कौशल की आवश्यकता नहीं है, और बैक्टीरियल आइसोलेट्स और प्रयोगशाला माउस उपभेदों की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रयोग किया जा सकता है. जैसे, यह एल द्वारा इस्तेमाल किया दोनों डाह रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए आदर्श मॉडल है monocytogenes

Introduction

लिस्टेरिया monocytogenes मानव में खाद्य जनित संक्रमण का कारण है कि ऐच्छिक इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल रोगज़नक़ों हैं. बैक्टीरिया नमकीन, इस तरह सुखाने के रूप में हमारे भोजन की आपूर्ति की रक्षा के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं के कई करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, या प्रशीतन 1,2 और संक्रमण आम तौर पर उपभोग करने से पहले गर्म नहीं कर रहे हैं कि प्रसंस्कृत, "रेडी टू ईट" खाद्य पदार्थों से जुड़े होते हैं . एल के कई पिछले प्रकोप में, स्रोत monocytogenes-दूषित भोजन की पहचान की थी, और उजागर व्यक्तियों के प्रतिबंधित समूह बारीकी से 3-6 नजर रखी थी. उन उदाहरणों में, अन्यथा स्वस्थ व्यक्तियों में नैदानिक ​​रोग एक हल्के, खुद को सीमित आंत्रशोथ से अधिक गंभीर आंतों और प्रणालीगत संक्रमण के लिए आवश्यक है कि अस्पताल में भर्ती. एल करने के लिए विविध नवजात शिशुओं और बुजुर्ग दोनों सहित प्रतिरक्षा समझौता व्यक्तियों, में monocytogenes संक्रमण भी एंटीबायोटिक उपचार के साथ, एक उच्च मृत्यु दर (25-30%) के साथ संबद्ध किया गया है एल के लिए संक्रामक खुराक के बारे में जाना जाता है monocytogenes, या एक छोटे पशु मॉडल की कमी के कारण मुख्य रूप से मौखिक संचरण के बाद संक्रमण के लिए संवेदनशीलता को नियंत्रित करने वाले मेजबान कारकों है कि संक्रमण के परिणामों का स्मरण दिलाता है यह विस्तृत श्रृंखला.

listeriosis की सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल चूहों की नसों (चार) टीका है. चार मॉडल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और संक्रमण 9,10 दौरान भोले और स्मृति दोनों टी सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी है. चार मॉडल का दोष यह है कि यह पूरी तरह से संक्रमण की आंतों चरण नजरअंदाज करता है. खाद्य जनित प्रसारण के बाद, पेट म्यूकोसा संभवतः धीमा कर देती है और लगातार परिधि के ऊतकों का प्रसार कर सकते हैं कि जीवाणुओं की संख्या को सीमित करता है कि एक बाधा प्रदान करता है. इसके विपरीत, पूरे inoculum चतुर्थ प्रशासन के मिनट के भीतर प्लीहा और जिगर में पाया जा सकता है, और जीव के इस बड़े सांस सहज प्रतिरक्षा घ हिला सकती हैइन ऊतकों में efenses. बड़ी खुराक (10 9 -10 11 CFU) आमतौर पर आंतों बसाना 10 प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं क्योंकि नलिका - पोषण द्वारा चूहों के मौखिक संक्रमण कम सामान्यतः प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, एक खिला सुई के साथ intragastric (आईजी) टीका प्रणालीगत प्रसार करने से पहले गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमण की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अवधि उत्पन्न नहीं करता है. कुछ प्रयोगशालाओं कि एल की सूचना दी है दूसरों 48 HPI 11-15 तक कोई प्रणालीगत प्रसार से पता चला है, जबकि monocytogenes, 4-12 घंटे बाद संक्रमण (HPI) के भीतर प्लीहा और यकृत तक पहुँचने. इस प्रयोगशाला से प्रयोगशाला भिन्नता घुटकी के अस्तर को मामूली आघात में परिणाम कर सकते हैं, आईजी टीका का आक्रामक स्वभाव का परिणाम हो, और बैक्टीरिया के प्रत्यक्ष खून आक्रमण को बढ़ावा देने सकता है.

हमने हाल ही में मौखिक एल के एक उपन्यास माउस मॉडल विकसित बारीकी से मानव रोग 16 के सभी चरणों mimics कि monocytogenes संक्रमण. चूहों cont के टुकड़े निगलना जब संक्रमण होता हैखाद्य, गैर दर्दनाक है कि एक ऐसी प्रक्रिया है, aminated और प्रयोगशाला जांचकर्ताओं द्वारा विशेष कौशल की आवश्यकता नहीं है. समय की एक असतत अवधि (36-48 घंटे) के लिए, एल monocytogenes reproducibly इस प्रकार पेट म्यूकोसा भर सरकाना और परिधि के ऊतकों के लिए प्रसार करने के लिए लिस्टेरिया रोगजनक द्वारा इस्तेमाल किया तंत्र की जांच के लिए अनुमति देता है, केवल जठरांत्र पथ उपनिवेश. महत्वपूर्ण बात है, मॉडल संक्रमण के लिए मेजबान जन्मजात प्रतिरोध में मतभेद का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पिछले एक अध्ययन में, हम BALB / ग / जम्मू चूहों द्वारा / एल की घातीय प्रतिकृति के साथ, भोजन जनित listeriosis को अत्यधिक अतिसंवेदनशील थे कि पता चला आंत, तिल्ली, जिगर, और पित्ताशय 16 में होने वाली monocytogenes. इसके विपरीत, C57BL 6 / चूहों एल का केवल क्षणिक उपनिवेशवाद के साथ, भोजन जनित संक्रमण के लिए प्रतिरोधी रहे थे monocytogenes इन ऊतकों में से प्रत्येक में होने वाली. बारीकी से मानव रोग mimics कि खाद्य जनित मॉडल की एक और विशेषता यह है कि प्राकृतिक प्रसार हैमस्तिष्क संक्रमण के बाद के चरणों (5-7 डीपीआई) के दौरान हुई है.

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Protocol

1. चयनित अग्रवाल मीडिया की तैयारी (BHI / एल + जी) आंत्र Microbiota बाधित करने के लिए

  1. 26 ग्राम ब्रेन हार्ट आसव अग्रवाल (Difco), 7.5 ग्राम LiCl और 5.0 ग्राम ग्लाइसिन और एक 1 लीटर फ्लास्क में जगह बाहर वजन. विआयनीकृत पानी की 500 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. एक चुंबकीय दोषी पर हीट अगर फोड़े जब तक, लगातार क्रियाशीलता. गर्मी बंद फ्लास्क लो, बुलबुले संक्षेप में बसा है, और उसके बाद फिर से एक फोड़ा करने के लिए वापस लाने के लिए.
  3. . एक तरल चक्र पर 16-19 साई के तहत 121 से कम 30 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए आटोक्लेव नोट: कुप्पी में हलचल बार छोड़ दें.
  4. डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 55 के लिए मीडिया को संतुलित करना या आरटी पर शांत करते हैं. समाधान डिग्री सेल्सियस या क्रिस्टल अगर में बनेगी 55 से कूलर प्राप्त करने की अनुमति नहीं है. क्रिस्टल एल रोकना नहीं है monocytogenes के विकास या मीडिया के चुनिंदा गुणों को प्रभावित. हालांकि, क्रिस्टल छोटी कालोनियों दिखने में समान हो जाएगा और यह मुश्किल बैक्टीरियल CFU गिनती करने के लिए कर देगा.
  5. धीरे मिश्रणएक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करते हुए 1 मिनट के लिए अगर. हवाई बुलबुले के गठन से बचें. पेट्री डिश (~ 25 मिलीग्राम / प्लेट) में अगर डालो.
    नोट: यह मीडिया के सभी एल के विकास का समर्थन नहीं करता monocytogenes के उपभेदों. उदाहरण के लिए, एल monocytogenes egde 36-48 घंटे के भीतर दिखाई कालोनियों के साथ, यह अगर पर अच्छी तरह से बढ़ता है, लेकिन 10403s इस मीडिया पर नहीं उगते.

2. Inoculum की तैयारी

  1. छोटे में कटा हुआ सफेद रोटी (क्रोगर) कट (2-3 मिमी) बाँझ कैंची ora बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग cubes. Crusts का उपयोग न करें. संक्रमण के दिन तक -20 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूबों में व्यक्तिगत टुकड़े स्टोर.
  2. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करना, नमकीन मक्खन (क्रोगर) के छोटे (0.5-1 सेमी) विखंडू में कटौती और एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में हर जगह है. 60 रोटी के टुकड़े - प्रत्येक ट्यूब 50 तैयार करने के लिए पर्याप्त मक्खन शामिल होंगे. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर की जरूरत तक.
  3. एल बढ़ो BHI शोरबा में monocytogenes और 30 में मिलातेडिग्री, संस्कृति ~ 0.8-1.0 की एक आयुध डिपो 600 तक पहुँच जाता है जब तक सी. नमूना अक्सर इतना ट्यूबों के सभी बैक्टीरिया के समान संख्या में भंवर, देखभाल करने के microcentrifuge ट्यूबों में 500 μl aliquots तैयार. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस
  4. , बैक्टीरियल aliquots के अनुमापांक बर्फ पर एक ट्यूब पिघलना करने के लिए, तो 500 μl 9.5 मिलीलीटर BHI शोरबा में जोड़ें. 30 से कम 1.5 घंटा खड़े लिए सेते डिग्री सेल्सियस BHI अगर पर प्लेट धारावाहिक dilutions. . सजातीय aliquots के लिए तैयार हैं, तो 2 से 4 गुना की एक विचरण के साथ एक समान तरीके से तैयार जब ट्यूबों में से प्रत्येक के इस अनुमापांक उपज की उम्मीद कर सकते हैं: ~ 1-5 x 10 8 CFU / एमएल नोट की एक अनुमापांक अपेक्षा करें.
  5. चूहों को संक्रमित करने के लिए, एल के एक विभाज्य तैयार monocytogenes के रूप में 2.4 चरण में वर्णित है. एल से पहले के बारे में 20 मिनट monocytogenes संस्कृति तैयार है, आरटी पर रोटी के टुकड़े पिघलना. 55 में मक्खन का एक विभाज्य पिघल डिग्री सेल्सियस और 55 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के पूर्व गर्म एक छोटी मात्रा कम से कम एक प्रति माउस इतना है कि वहाँ पर्याप्त रोटी के टुकड़े को तैयारसंक्रमित और वास्तविक inoculum की अनुमापांक का निर्धारण करने के लिए कम से कम एक अतिरिक्त टुकड़ा किया जाना है.
  6. बैक्टीरियल विभाज्य की पूर्व निर्धारित अनुमापांक के आधार पर, एल की कुल मात्रा की गणना monocytogenes संस्कृति रोटी के टुकड़े की अपेक्षित संख्या के लिए inocula तैयार करने की जरूरत. 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर centrifuging द्वारा गोली बैक्टीरिया सभी BHI शोरबा महाप्राण और पूर्व गर्म पीबीएस (2 μl / रोटी का टुकड़ा) की एक छोटी मात्रा में बैक्टीरिया resuspend.
  7. भंवर घी, बैक्टीरिया (3 μl / रोटी टुकड़ा के बराबर कुल मात्रा का उपयोग करके) को जोड़ने और मिश्रण अच्छी तरह से ध्यान दें:. एक समय या मक्खन जमना में अधिक से अधिक 10-15 रोटी के टुकड़े को तैयार करने का प्रयास न करें.
  8. , जल्दी से एक microcentrifuge ट्यूब में एक भी रोटी के टुकड़े पर जीवाणु निलंबन की पिपेट 5 μl कार्य करना. समाधान पूरी तरह से रोटी टुकड़ा द्वारा अवशोषित किया जाना चाहिए.
  9. Inoculum की वास्तविक अनुमापांक निर्धारित करने के लिए, रोटी piec में से एक के लिए 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस जोड़नेतों. 1 मिनट के लिए सख्ती भंवर. धारावाहिक dilutions और प्लेट BHI और BHI / एल दोनों + जी अगर तैयार.
  10. उच्च टिटर (> 10 9 CFU) inocula के लिए वैकल्पिक प्रक्रिया. बैक्टीरिया गोली बहुत बड़ी है, तो यह एक ऐसी छोटी मात्रा में निलंबित करने के लिए मुश्किल हो सकता है, और जिसके परिणामस्वरूप सामग्री एक पेस्ट की तरह, बहुत चिपचिपा है, और inoculum के कुछ microcentrifuge ट्यूब के पक्षों के लिए छड़ी सकता है. इस मामले में, यह एक बाँझ 60 मिमी संस्कृति डिश में रोटी टीका लगाना, और (देखें नीचे) माउस को पूरे पकवान (ढक्कन) के बिना की पेशकश करने के लिए बेहतर है. रोटी से अवशोषित नहीं है कि किसी भी अतिरिक्त inoculum तो माउस से सीधे खाया जा सकता है. बहुत उच्च टिटर inocula के साथ काम कर जब सामान्य में, यह रोटी के सभी खाते और नीचे वर्णित मानक प्रोटोकॉल से साफ पकवान चाटना करने के लिए चूहों के लिए अब लगता है, तो यह केवल पसंदीदा तरीका है.

3. चूहे का संक्रमण

  1. महिला BALB / ग / जम्मू (शेयर # 0010026) और C57BL/6/J तक / (शेयर खरीद# 000,644) जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, इ) से और उम्र के 6-9 सप्ताह में उपयोग करें.
  2. फास्ट फूड को हटाने और उठाया (1 इंच) तार फर्श (# 3 मेष, एलेनटाउन) पर चूहों रखकर संक्रमण से पहले चूहों एक दिन (24 घंटे) coprophagy रोकने के लिए. केवल पर्याप्त मूत्र को अवशोषित करने के लिए पिंजरे में बिस्तर, लेकिन शेड मल तरक्की करने के लिए पर्याप्त नहीं छोड़ दें. पानी के लिए अप्रतिबंधित उपयोग की अनुमति दें.
  3. एक लाल बत्ती बल्ब के साथ outfitted एक लामिना का प्रवाह हुड में काम कर रहा है, अंधेरे चक्र की शुरुआत में चूहों को संक्रमित. एक खाली (कोई बिस्तर) पिंजरे में एक माउस स्थानांतरण. एक बाँझ संदंश का प्रयोग, खाली पिंजरे के नीचे करने के लिए दूषित रोटी टुकड़ा हस्तांतरण. आमतौर पर, माउस रोटी टुकड़ा ले जाएगा और 2-10 मिनट के भीतर पूरी तरह से यह खपत करते हैं. माउस सही दूर रोटी खाने को नहीं होता है, तो 20-30 मिनट के लिए undisturbed माउस रैक और छोड़ने के लिए पिंजरे वापसी. जानवरों का बहुमत इस समय सीमा के भीतर रोटी खायेंगे, फिर भी, चूहों ओ.टी. के लिए उपयोग के बिना, undisturbed छोड़ दिया जा सकता हैऊपर 2 घंटा करने के लिए उसके भोजन या पानी.
  4. संक्रमण के बाद, अपने मूल पिंजरे के लिए माउस लौटने और माउस चाउ की भरपाई होगी. प्रयोग की अवधि के लिए उठाया तार फर्श पर चूहों के घर में जारी.

4. बैक्टीरिया के स्तर की निगरानी के मल में शेड

  1. लेबल और पूर्व तौलना microcentrifuge ट्यूबों मल के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. चूहों के एक पिंजरे पुन: प्राप्त करने के बाद जल्दी से काम करते हुए, एक 500 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर में प्रत्येक माउस जगह. आमतौर पर चूहों के 5 मिनट के भीतर 1-4 मल छर्रों को निष्कासित करेंगे.
  3. उचित लेबल ट्यूबों को मल के हस्तांतरण के लिए एक बाँझ संदंश का प्रयोग करें.
  4. प्रत्येक ट्यूब वजन और खाली ट्यूब के वजन घटाकर मल के वजन की गणना. Fecal छर्रों के लिए ठेठ वजन 10-30 मिलीग्राम से लेकर.
  5. प्रत्येक ट्यूब (200 μl/30 मिलीग्राम मल) को पीबीएस जोड़ें और मैश fecal छर्रों के लिए एक बाँझ दन्तखुदनी का उपयोग करें.
  6. 30 सेकंड के लिए भंवर प्रत्येक ट्यूब, तो BHI / एल पर धारावाहिक dilutions और थाली तैयार+ जी अगर. कालोनियों की संख्या की गणना और CFU / मिलीग्राम मल गणना.

5. संक्रमित आंतों के ऊतकों की प्रोसेसिंग

  1. चूहों euthanize, aseptically एक भी ऊतक के रूप में प्रत्येक माउस से पेट और आंतों फसल और खाली 100 मिमी पेट्री डिश में इकट्ठा.
  2. छोटी आंतों, अंधान्त्र, और बर्फ पर संग्रहीत अलग 60 मिमी व्यंजन में पेट और जगह अलग करें. छोटी आंतों आगे ग्रहणी, सूखेपन, और luminal सामग्री को हटाने की सुविधा के लिए लघ्वान्त्र approximating तीन बराबर टुकड़ों में लंबाई से विभाजित किया जा सकता है. ऊतक तिहाई तो या तो एक साथ संसाधित (पूरी छोटी आंतों प्रति CFU के लिए) या अलग किया जा सकता है. ~ 0.5 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ गीले ऊतकों लचीला रखने और हैंडलिंग के दौरान आँसू रोकने के लिए.
  3. 8 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और एक 25 ग्राम सुई देते हैं. बर्बादी बीकर (या एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब luminal जीवाणु एकत्रित हो तो) में luminal सामग्री बाहर निचोड़ बाँझ संदंश का प्रयोग करें. Flusऊतक के एक छोर से ज 4 मिलीलीटर पीबीएस, सामग्री बाहर निचोड़ संदंश का उपयोग करें, और तब दूसरे छोर पर ऊतक पर फ्लिप और दोहराने.
  4. Luminal सामग्री में लिस्टेरिया की संख्या यों, 0.5 में गोली निलंबित, 12,000 XG पर 20 मिनट के लिए जमा फ़्लश अपकेंद्रित्र - 1.0 मिलीलीटर बाँझ पानी.
  5. लिस्टेरिया सेल जुड़े राशि की कुल संख्या यों, छोटे टुकड़ों में ऊतक टुकड़ा करने के लिए कई पार्श्व कटौती कर तो बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ अनुलंबीय काटने से प्रत्येक धोया ऊतक खुला, और ध्यान दें:. इस कदम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि आंतों के ऊतकों homogenizer के ब्लेड के आसपास लपेटो नहीं है. 2 मिलीलीटर बाँझ पानी युक्त एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब आंतों टुकड़े स्थानांतरण.
  6. 30 सेकंड के लिए 60% बिजली पर 70% इथेनॉल में जांच रखकर एक ऊतक homogenizer (फिशर Powergen 1000) जीवाणुरहित. 10 सेकंड के लिए बाँझ पानी में शुष्क हवा के लिए इथेनॉल, या प्रक्रिया के लिए प्रतीक्षा करें. प्रत्येक ती homogenize1 मिनट के लिए ssue. प्रत्येक नमूने के बीच बाँझ पानी के साथ उपचार दोहराएँ, और नमूना समूहों के बीच 70% इथेनॉल का उपयोग करें.
  7. बाँझ पानी और BHI / एल + जी अगर पर थाली में प्रत्येक नमूने के धारावाहिक dilutions तैयार.

6. संक्रमित mesenteric लिम्फ नोड्स के प्रसंस्करण

  1. हार्वेस्ट लिम्फ aseptically नोड्स, बर्फ पर एक बाँझ 60 मिमी पकवान में जगह है, और सभी संलग्न वसा को हटाने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें. माउस प्रति 3-6 नोड्स पाने की उम्मीद.
  2. स्टेनलेस स्टील # 80 जाल का 1.5-2 इंच चौकोर टुकड़ों को काटने से तार जाल स्क्रीन तैयार. प्रत्येक कोने में एक छोटा सा कटौती करें, और एक उठाया बिस्तर बनाने, चार पक्षों नीचे गुना. 0.75 मिलीलीटर बाँझ पानी युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश में 95% इथेनॉल और फिर बाँझ लौ, और जगह में डुबकी. प्रत्येक उपयोग के बाद, स्क्रीन, 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने एम्बेडेड ऊतकों को हटाने के लिए एक ब्रश के साथ scrubbing, 2N NaOH में 20-30 मिनट के लिए उबलते, और फिर पानी के साथ बड़े पैमाने पर निस्तब्धता से साफ किया जा सकता है.
  3. सवार का प्रयोग करेंजाल स्क्रीन के माध्यम से एक बाँझ 3 मिलीलीटर सिरिंज से मुहब्बत करने नोड्स. यह पकवान में पानी के संपर्क में आता है तो पकवान के नीचे करने के लिए स्क्रीन पर नीचे पुश करने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. स्क्रीन के माध्यम से 0.75 मिलीलीटर बाँझ पानी से गुजरती हैं और फिर स्क्रीन कुल्ला करने के लिए कई बार नीचे विंदुक ऊपर और. एक microcentrifuge ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
  5. भंवर प्रत्येक नमूना सख्ती 30 सेकंड के लिए कोशिकाओं lyse. या तो BHI / एल + जी अगर पर धारावाहिक dilutions और थाली तैयार है.

7. संक्रमित Spleens, यकृत, और पित्त bladders के प्रसंस्करण

  1. बाँझ संदंश के साथ तिल्ली समझ और दो में कटौती, प्रत्येक के अंत में एक करके मुक्त कराया. 2.5 मिलीलीटर बाँझ पानी युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें. (नोट: दौर पैंदा के साथ ट्यूब homogenizer के साथ उपयोग करने के लिए आसान हो सकता है.)
  2. पित्ताशय (जिगर से जुड़े एक छोटे पीले रंग के तरल पदार्थ से भरी थैली) और फोड़ के बिना जिगर से अलग करने के लिए बाँझ कैंची के साथ सावधानी से कटाव का पता लगाएँ. Transf1 मिलीलीटर बाँझ पानी युक्त एक microcentrifuge ट्यूब एर.
  3. Aseptically, जिगर को हटाने के सभी खण्डों को दूर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है, और बाँझ पानी की 2.5 मिलीग्राम से युक्त एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण.
  4. के रूप में 60% बिजली पर 30 सेकंड के लिए ऊपर वर्णित spleens और यकृत homogenize. Forgall मूत्राशय, 30 सेकंड के लिए सख्ती भंवर तो microcentrifuge ट्यूब में फाड़ बाँझ कैंची का उपयोग, और.
  5. धारावाहिक dilutions और BHI या BHI / एल पर या तो थाली प्रत्येक नमूना + जी अगर तैयार.

8. संक्रमित दिमाग का प्रसंस्करण

  1. माउस के पीछे की ओर से कार्य करना, एक 45 डिग्री के कोण पर गर्दन ऊपर त्वचा और ऊतक में कटौती, और दोनों कान भर में. नाक की ओर खींच कर त्वचा की यू के आकार का फ्लैप बंद छील करने के लिए एक बाँझ संदंश का प्रयोग करें और खोपड़ी और चेहरे की हड्डियों का पर्दाफाश.
  2. एक संदंश के साथ आंखों के बीच बोनी रिज पकड़े द्वारा खोपड़ी स्थिर, और खोपड़ी के पार्श्व किनारों भर में उथले कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें. होनाकेवल हड्डी नहीं है और मस्तिष्क के ऊतकों में कटौती करने के लिए सावधान. अगला, आंखों के बीच बोनी रिज कटौती. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए (गर्दन की ओर) खोपड़ी के शीर्ष पकड़ और पीछे की ओर खींचने के लिए एक संदंश का प्रयोग करें.
  3. धीरे 1.5 मिलीलीटर बाँझ पानी युक्त एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक बाँझ संदंश और जगह का उपयोग कर अपने गुहा से मस्तिष्क उठा.
  4. ऊपर वर्णित के रूप में 60% बिजली पर 20 सेकंड के लिए homogenize. BHI या BHI / एल + जी अगर किसी पर धारावाहिक dilutions और थाली तैयार है.

9. पूरक प्रक्रिया: आंतों के ऊतकों की Fractionation

बलगम अंश में बैक्टीरिया की 9.1 अलगाव

  1. प्रत्येक आंतों के ऊतकों के लिए, 6 मिमी एन एसिटाइलसिस्टीन (, सिग्मा # ए 9165 एनएसी) की 3 मिलीग्राम से युक्त 3 ट्यूबों तैयार करते हैं.
  2. लाल प्लेस और अनुलंबीय सख्ती हर 20-30 सेकंड घूमता, 1-2 मिनट के लिए पहली ट्यूब में ऊतक में कटौती. बाँझ संदंश का प्रयोग, ऊतक उठाओ और धीरे से अतिरिक्त liqu दूर करने के लिए ट्यूब के पक्ष के खिलाफ निचोड़आईडी.
  3. शेष एनएसी ट्यूब का उपयोग दो बार और कदम 9.1.2 दोहराएँ. आंतों के ऊतकों को निकालें और आगे की प्रक्रिया के लिए अलग सेट.
  4. पूल एनएसी (9 मिलीलीटर की कुल) washes, और 12,000 x जी पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  5. 30 सेकंड के लिए बाँझ पानी, भंवर में गोली Resuspend, BHI / एल + जी पर धारावाहिक dilutions और थाली तैयार

उपकला सेल (ईसी) अंश में बैक्टीरिया की 9.2 अलगाव

  1. 5% FBS के (आर पी -5), 5 मिमी EDTA, और 1 मिमी डीटीटी के साथ पूरक RPMI के 5 मिलीलीटर (Invitrogen # 21870) युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ कैंची और जगह के साथ छोटे टुकड़ों में प्रत्येक ऊतक में कटौती. डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए 37 में मिलाते सेते हैं.
  2. 5 मिलीलीटर RP5/EDTA/DTT युक्त एक ताजा ट्यूब आंतों टुकड़े स्थानांतरण और 37 में मिलाते ° सी 20 मिनट के लिए सेते हैं. पहली ट्यूब से मीडिया को सहेजें और 37 पर अलग सेट डिग्री सेल्सियस RP5/EDTA/DTT में तीन 20 मिनट incubations की कुल के लिए एक बार फिर इस प्रक्रिया को दोहराएं. लामिना propria आईएसओ को आगे बढ़ने से तोआबादी कदम, खाली 50 मिलीलीटर ट्यूब में शेष आंतों टुकड़े हस्तांतरण.
  3. तीन RP5/EDTA/DTT washes के (15 मिलीलीटर की कुल मात्रा) और गोली कोशिकाओं के लिए कम गति (1,200 XG) अपकेंद्रित्र जुडा है.
  4. कोशिकी बैक्टीरिया यों, 12,000 एक्स जी पर 20 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला और अपकेंद्रित्र इकट्ठा. 0.5 में गोली Resuspend - BHI / एल पर 1.0 मिलीलीटर बाँझ पानी और थाली धारावाहिक dilutions + जी अगर.
  5. इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया गणना करने के लिए, 25 ग्राम / एमएल gentamicin युक्त आरपी-5 के 5 मिलीलीटर में चुनाव आयोग गोली resuspend. 37 पर 30 मिनट के लिए एकल कक्ष निलंबन सेते डिग्री सेल्सियस से अधिक 7% मारने के लिए सीओ 2 के किसी भी शेष बाह्य एल monocytogenes. कोशिकाओं lyse करने के लिए 30 सेकंड के लिए 0.5 मिलीलीटर बाँझ पानी, और भंवर में निलंबित, पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धोएं. BHI / एल + जी पर पानी और प्लेट में धारावाहिक dilutions तैयार
    नोट: इस स्तर पर एकत्र कोशिकाओं अंतर्निहित Peyer पैच से कोशिकाओं को भी शामिल होंगे. अगर वांछित, दिखाई Peyer हैपैच निस्तब्धता और अनुलंबीय काटने से पहले आंतों के ऊतकों से हटाया जा सकता है.

लामिना propria (एलपी) अंश में बैक्टीरिया की 9.3 अलगाव

  1. ट्यूब से 25 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस जोड़कर आंतों टुकड़े से अतिरिक्त डीटीटी / EDTA के कुल्ला. सख्ती से हिला, एक ताजा ट्यूब में हस्तांतरण और दो बार दोहराएँ.
  2. 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते 1 मिलीग्राम / एमएल प्रकार चतुर्थ collagenase और 40 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं सेते के साथ पूरक आरपी -5 से मिलकर पाचन समाधान के 4 मिलीलीटर युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को पेट के टुकड़े स्थानांतरण.
  3. 4 मिलीग्राम पाचन समाधान युक्त एक ताजा ट्यूब में पचाया टुकड़े स्थानांतरण और ऊतक टुकड़े पूरी तरह से पचा रहे हैं जब तक एक बार या दो बार दोहराएँ. 37 पर मुक्त एल.पी. कोशिकाओं के होते हैं, जो पाचन समाधान, में से प्रत्येक डिग्री सेल्सियस सहेजें
  4. गोली कोशिकाओं के लिए कम गति (1,200 XG) में जमा पाचन समाधान अपकेंद्रित्र. Descr के रूप में सतह पर तैरनेवाला और सेल गोली अलग से संसाधितक्रमशः, बाह्य और intracellular बैक्टीरिया गणना करने के लिए ऊपर ibed.

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Representative Results

एल monocytogenes कालोनियों 37 डिग्री सेल्सियस से कम 36-48 घंटे ऊष्मायन के बाद BHI / एल + जी प्लेटों पर दिखाई जाएगी कालोनियों एक चिकनी, गुंबद के आकार मलाईदार सफेद उपस्थिति (चित्रा 1 ए) है. विकास आंतों microbiota के बहुमत के लिए हिचकते हैं, लेकिन यह एल नहीं कर रहे हैं कि कुछ कालोनियों को देखने के लिए आम है किया जाएगा monocytogenes, सीधे महत्वपूर्ण कमजोर पड़ने (चित्रा 1 बी) के बिना छोटी आंत या पेट के चढ़ाना खासकर जब. संदिग्ध कालोनियों ChromAgar टीएम लिस्टेरिया प्लेटों पर चढ़ाना से इसकी पुष्टि की जा सकती है. एल नीले कालोनियों इन प्लेटों पर एक सफेद प्रभामंडल (चित्रा 1C) से घिरा के रूप में monocytogenes के दिखाई देते हैं. एल के लिए पता लगाने की सीमा प्रत्येक ऊतक में monocytogenes के ऊतक homogenize करने के लिए उपयोग किए गए पानी की मात्रा पर निर्भर है. तालिका 1 में दिखाया नमूना संस्करणों को प्रभावी ढंग से प्रत्येक ऊतक प्रक्रिया की जरूरत कम से कम मात्रा का प्रतिनिधित्व करते हैं. तिल्ली के homogenates, जीसभी मूत्राशय, मस्तिष्क, या fractionated आंतों ऊतक 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है और यदि आवश्यक हो तो फिर चढ़ाया जा सकता है. आंतों, छोटी आंत या जिगर homogenates कुछ एल बाधित कर सकते हैं monocytogenes के विकास नमूना जब तक (चित्रा -1) पर्याप्त पतला है, और इन homogenates 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद इसी तरह की CFU मायने रखता है फिर चढ़ाया अगर उपज नहीं है

हम पहले से BALB / ग / जम्मू (BALB) चूहों से C57BL / / 6 (बी -6) चूहों 16 से खाद्य जनित listeriosis को काफी अधिक अतिसंवेदनशील थे. 10 7 CFU के एक inoculum BALB चूहों में आंत्र संक्रमण की स्थापना के लिए पर्याप्त है, लेकिन कम से कम 10 8 CFU के बी -6 चूहों (चित्रा 2) के जठरांत्र पथ उपनिवेश स्थापित करने की जरूरत है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, आंतों, तिल्ली, जिगर और पित्ताशय में जीवाणु लोड चूहों को दी चुनौती खुराक के लिए आनुपातिक हो जाएगा. प्रारंभिक अध्ययन 5 एक्स 9 10 CFU है कि सुझावBALB / ग यह मॉडल 16 का उपयोग करते हुए / जम्मू चूहों द्वारा / के लिए अनुमानित एलडी 50.

चित्रा 1
चित्रा 1. चयनात्मक अगर प्लेटों पर प्रतिनिधि कॉलोनी विकास. ए) एल monocytogenes कालोनियों BHI / एल पर 48 घंटा विकास + जी अगर बाद. बी) BHI / एल + जी अगर सबसे आंतों microbiota के विकास को रोकता है, लेकिन कुछ गैर लिस्टेरिया कालोनियों (तीर) कम dilutions पर देखा जा सकता है. यहाँ दिखाए अगर प्लेट) 100 प्लेट के आधे पर एक 10 -1 कमजोर पड़ने के μl, और 50 एक पेट के homogenate के 10 -2 और 10 -3 dilutions की प्रत्येक μl. सी होता एल monocytogenes कालोनियों CHROM अगर लिस्टेरिया प्लेटों पर विकास से इसकी पुष्टि की जा सकती है. एल monocytogenes कॉलोनी के आसपास एक सफेद प्रभामंडल के साथ नीले रंग दिखाई देते हैं. डी) यह है के लिए असामान्य नहीं हैई एल की एक अवरोध BHI / एल + जी अगर पर आंतों या जिगर homogenates प्लेटों या तो की सबसे कम कमजोर पड़ने में अलग आकार की कालोनियों में जिसके परिणामस्वरूप monocytogenes के विकास,.

चित्रा 2
चित्रा 2. BALB / ग / जम्मू और C57BL 6 / चूहों द्वारा /. महिला BALB / ग / जम्मू (BALB) और C57BL / 6 (बी -6) चूहों द्वारा / में खाद्य जनित संक्रमण की खुराक प्रतिक्रिया, 10 9 (एन = 7) से संक्रमित थे 10 8 (एन = 8), 10 7 (एन = 6) और 10 6 (एन = 4) एल एम InlA मीटर और प्रत्येक ऊतक में CFU की संख्या 5 डीपीआई निर्धारित किया गया था. एसडी दिखाया जाता है - / + मूल्यों मतलब है. दो अलग प्रयोगों से pooled डेटा का विश्लेषण किया गया. धराशायी लाइनों के प्रत्येक अंग में पता लगाने की सीमा से संकेत मिलता है.

ऊतक नमूना मात्रा (एमएल) के एक पता लगाने की सीमा (CFU)
छोटी आंत 2.0 50
अंधान्त्र 2.0 50
बृहदान्त्र 2.0 50
Mesenteric लिम्फ नोड्स 1.5 15
तिल्ली 2.5 50
जिगर 2.5 50
पित्ताशय 0.5 10
मस्तिष्क 1.5 15

तालिका 1. एल के लिए पता लगाने की सीमा. ऊतक homogenates में monocytogenes. बाँझ पानी प्लस homogenized ऊतक से मिलकर एक औसत कुल नमूना मात्रा.

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Discussion

जन्मजात चूहों दिन के हर समय खिलाने के लिए समान रूप से स्वीकार नहीं कर रहे हैं, और दूषित रोटी खाने के लिए अपनी इच्छा दोनों तनाव प्रकार और चूहों 17 साल की उम्र पर निर्भर करेगा. हमारे अनुभव में, 6-9 सप्ताह पुराने बी -6 चूहों दिन के किसी भी समय खिलाने के लिए स्वीकार कर रहे हैं, लेकिन यह उनके गहरे चक्र के दौरान की पेशकश की है जब तक BALB चूहों लगातार रोटी टुकड़ा खा नहीं होगा. अंधेरे चरण प्रयोगशाला कर्मियों के लिए सामान्य कार्य दिवस के साथ मेल खाता है तो पशुओं को रखने के लिए इस्तेमाल किया कमरे का प्रकाश चक्र बदला जा सकता है. हालांकि, चूहों से पहले संक्रमण को बदल प्रकाश चक्र के लिए acclimate करने के लिए कम से कम दो हफ्ते का वक्त दिया जाना चाहिए. संक्रमण के दौरान, केवल लाल लैंप या तो कमरे में ही या लामिना का प्रवाह हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

इस मॉडल को विकसित करने में, रोटी एल संचारित करने के लिए खाद्य स्रोत के रूप में चुना गया था रोटी शोषक है क्योंकि मोटे तौर पर monocytogenes. इस प्रकार, यह वें के साथ छोटे टुकड़ों को तर करने के लिए आसान थाई बैक्टीरियल inoculum और प्रत्येक माउस एक ही खुराक किया जाता है कि यह सुनिश्चित करें. हालांकि, इस मॉडल को आसानी से अन्य खाद्य स्रोतों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. दरअसल, इस सीधे बैक्टीरियल संक्रामकता पर भोजन की संरचना या भंडारण की स्थिति के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि केवल माउस मॉडल है. एल monocytogenes आसानी से उच्च नमक, कम पीएच, या ठंडे तापमान 1,2,18 में वृद्धि करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं, लेकिन ये विकास की स्थिति आंत्र संक्रमण की स्थापना के लिए बैक्टीरिया की क्षमता को बदल अगर यह ज्ञात नहीं है.

लगभग 10 मिनट के एक माउस से संक्रमित अंगों के सभी फसल के लिए की जरूरत है. पित्ताशय आसानी से उठी है, तो पहली बार इसे दूर करने के लिए सबसे अच्छा है. mesenteric लिम्फ नोड्स आंतों परेशान नहीं किया गया है जब हाजिर करने के लिए आसान कर रहे हैं, ताकि वे अगले हटाया जाना चाहिए. आंतों सिर्फ पेट के नीचे और सिर्फ परिशिष्ट ऊपर काटने से एक भी ऊतकों के रूप में काटा, और फिर ileu, सूखेपन, ग्रहणी में विभाजित किया जा सकता हैमी, अंधान्त्र, और पेट के ठीक पहले निस्तब्धता और homogenizing लिए. प्लीहा और यकृत आम तौर पर अगले हटा रहे हैं, और मस्तिष्क यह खोपड़ी का उपयोग करने के लिए माउस पर बारी करने के लिए आवश्यक है, के रूप में peritoneal गुहा से अंगों को पुन: प्राप्त करने के बाद काटा जाता है. संसाधित तक कई चूहों के साथ काम करते हैं तो सभी ऊतकों बर्फ पर संग्रहित किया जाना चाहिए. सबसे ऊतकों के लिए, अगर प्लेट ऊतक में CFU वर्तमान की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. थाली तिहाई में विभाजित किया गया था, और ऊतक homogenate की तीन अलग dilutions की एक 50-100 μl नमूना प्रत्येक तीसरे पर चढ़ाया गया था.

यहाँ वर्णित विधि एल की कुल संख्या की पहचान करेगा प्रत्येक माउस के ऊतकों में monocytogenes, इंट्रासेल्युलर जीवों नहीं बस. एल का अनूठा इंट्रासेल्युलर जीवन शैली monocytogenes संक्रमण 18,19 के दौरान एक महत्वपूर्ण डाह निर्धारक माना जाता है. हालांकि, एल monocytogenes ऐच्छिक, लाचार नहीं, intracellular रोगज़नक़ों, और वहाँ रहे हैंई वास्तव में vivo में कोशिकाओं के भीतर रहते हैं कि लिस्टेरिया का प्रतिशत इंगित करने के लिए कोई निश्चित प्रकाशित रिपोर्ट कर रहे हैं. मौखिक एल का उपयोग करते हुए सबसे पहले पढ़ाई monocytogenes संक्रमण आंतों microbiota के विकास को बाधित करने के लिए पेट के ऊतकों की जेंटामाइसिन इलाज पर भरोसा किया. Gentamicin साथ पूर्व उपचार बाह्य एल को खत्म करने की क्षमता है monocytogenes, यह हद जेंटामाइसिन इन विट्रो में पूरी आंतों के ऊतकों घुसना करने में सक्षम है क्या करने के लिए स्पष्ट नहीं है, हालांकि केवल इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की वसूली की अनुमति. यहाँ वर्णित पूरक प्रोटोकॉल बलगम परत, उपकला, और संक्रमित आंतों के ऊतकों की लामिना propria डिब्बे में बाह्य और intracellular बैक्टीरिया दोनों के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. इस प्रक्रिया में, जेंटामाइसिन सभी बरामद बैक्टीरिया ऊतक के भीतर कोशिकाओं के अंदर थे सुनिश्चित करना है कि एकल कक्ष निलंबन के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है.

एनएसी के साथ तीन washes आम तौर पर फिर सेआंतों के ऊतकों से बलगम के बहुमत ले जाया गया, और जमा washes के रूप में trypan नीले धुंधला द्वारा निर्धारित किसी भी कोशिकाओं (व्यवहार्य या मृत), शामिल नहीं किया था. Cytospin स्लाइड तैयारी की डिफ-क्विक धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में अतिरिक्त धोने दिखाई बलगम उपज नहीं था. चुनाव आयोग और एल.पी. अंशों की कोषमयता भी डिफ-क्विक या Giemsa धुंधला का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है. चुनाव आयोग के अंश आसानी से आंतों उपकला में मौजूद कुछ अंतःउपकला लिम्फोसाइटों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जो मुख्य रूप से उपकला कोशिकाओं से मिलकर चाहिए. एल.पी. अंश भड़काऊ monocytes ऊतक घुसपैठ जब संक्रमण के बाद रचना है कि परिवर्तन mononuclear कोशिकाओं का एक मिश्रण युक्त, और अधिक विविध है.

listeriosis के भोजन जनित मॉडल एल की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रयोग किया जा सकता है सहित monocytogenes वियोजन, माउस अनुकूलित InlA मीटर व्यक्त तनाव 15, यहाँ जंगली प्रकार egde, और विलोपन उत्परिवर्ती DERI वर्णितइन उपभेदों 16 vatives. पिछले एक अध्ययन में, हम आंतों उपनिवेशवाद का स्तर इन उपभेदों के बीच काफी भिन्न नहीं था कि पता चला है, तथापि, murine ई cadherin के लिए एक उच्च समानता ligand व्यक्त नहीं किया कि आइसोलेट्स mesenteric लिम्फ नोड्स के प्रसार में एक मामूली दोष था और तिल्ली 16. इसी तरह, किसी भी माउस तनाव इस बैक्टीरियल रोगजनन और मेजबान संक्रमण के लिए प्रतिक्रियाओं दोनों का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली है, जिससे संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम अभी तक सीधे इस परीक्षण नहीं किया है, हालांकि अंत में, हम यहां इस्तेमाल बुनियादी प्रक्रियाओं ऐसे साल्मोनेला, Yersinia, एस्चेरिचिया, कैम्पिलोबैक्टर और Citrobacter प्रजाति के रूप में अन्य खाद्य वहन बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए व्यापक रूप से लागू किया जाना चाहिए कि प्रस्ताव.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित. यहाँ वर्णित सभी प्रयोगों केंटकी विश्वविद्यालय में ICAUC की मंजूरी के साथ प्रयोगशाला पशु कल्याण (OLAW) के लिए कार्यालय के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया.

Acknowledgments

इस काम SEFD को सम्मानित राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (AI079442 और AI091918) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Agar Difco BD-241830
Lithium chloride Sigma L9650
Glycine Omnipur 4840
EDTA Gibco 15575-038
DTT Sigma D5545
Collagenase, type IV Worthington LS004089
DNAse I Worthington LS002007
Diff-Quik Dade-Behring B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer Fisher 14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80 Small Parts, Inc. CX-0080-C
Cytospin Statspin M801-22

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References

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की मौखिक संचरण<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; दूषित भोजन की घूस के माध्यम से चूहों में
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Bou Ghanem, E. N., Myers-Morales,… More

Bou Ghanem, E. N., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food. J. Vis. Exp. (75), e50381, doi:10.3791/50381 (2013).

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