Summary
Questo documento descrive un nuovo metodo per l'infezione orale di topi usando
Abstract
L. monocytogenes sono facoltativi batteri patogeni intracellulari che causano le infezioni di origine alimentare nell'uomo. Molto poco si sa circa la fase gastrointestinale di listeriosi a causa della mancanza di un piccolo modello animale che mima da vicino la malattia umana. Questo articolo descrive un nuovo modello murino per la trasmissione orale di L. monocytogenes. Utilizzando questo modello, i topi nutriti L. monocytogenes-contaminato pane hanno una discreta fase di infezione gastrointestinale, seguito da vari gradi di diffusione sistemica sensibili (BALB / c / da / J) o resistenti (C57BL / 6) ceppi di topi. Durante le ultime fasi di infezione, si osserva la diffusione della cistifellea e del cervello. Il modello di origine alimentare listeriosi è altamente riproducibile, non richiede competenze specialistiche, e può essere utilizzato con un'ampia varietà di isolati batterici e ceppi di topi di laboratorio. Come tale, è il modello ideale per studiare entrambe le strategie utilizzate virulenza di L. monocytogenes
Introduction
Listeria monocytogenes sono facoltativi batteri patogeni intracellulari che causano le infezioni di origine alimentare nell'uomo. I batteri sono resistenti a molti dei processi utilizzati per proteggere il nostro approvvigionamento alimentare, quali l'essiccazione, la salatura, o 1,2 refrigerazione e le infezioni sono in genere legati a trattati, "ready-to-eat" cibi non riscaldati prima del consumo . In diverse epidemie precedenti, la fonte di L. cibo monocytogenes-contaminato è stato identificato, e il gruppo ristretto di individui esposti è stata monitorata attentamente 3-6. In questi esempi, la malattia clinica in individui altrimenti sani varia da un lieve, autolimitante gastroenterite per infezioni intestinali e sistemiche più gravi che ha richiesto ospedalizzazione. L. infezioni monocytogenes in individui immunocompromessi, inclusi sia i neonati e gli anziani, sono stati associati con un alto tasso di mortalità (25-30%), anche con il trattamento antibiotico
Il modello più diffuso di listeriosi è per via endovenosa (IV) inoculazione di topi. Il modello IV è altamente riproducibile, ed è stato estremamente utile per studiare le risposte delle cellule sia naïve e memory T durante l'infezione 9,10. L'inconveniente del modello iv è che bypassa completamente la fase di infezione intestinale. Dopo la trasmissione di origine alimentare, la mucosa intestinale fornisce una barriera che rallenta presumibilmente e limita il numero di batteri che possono continuamente diffondere ai tessuti periferici. In contrasto, l'intero inoculo può essere trovata nella milza e nel fegato in pochi minuti di somministrazione endovenosa, e questo grande bolo di microrganismi può sopraffare immunitaria innata defenses in questi tessuti. Infezione orale di topi con sonda gastrica è meno comunemente usato, perché grandi dosi (10 9 -10 11 CFU) sono in genere tenuti a raggiungere la colonizzazione intestinale 10. Inoltre, intragastrica (ig) inoculazione con un ago di alimentazione non genera un periodo riproducibile di infezione gastrointestinale prima diffusione sistemica. Alcuni laboratori hanno segnalato che L. monocytogenes raggiungono la milza e il fegato entro 4-12 ore dopo l'infezione (HPI), mentre altri non hanno mostrato alcuna diffusione sistemica fino a 48 HPI 11-15. Questa variazione da laboratorio a laboratorio può essere una conseguenza della natura invasiva ig inoculazione, che può provocare traumi minori alla mucosa dell'esofago, e promuovere la circolazione sanguigna invasione diretta dei batteri.
Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo modello murino di orale L. infezione monocytogenes che imita da vicino tutte le fasi della malattia umana 16. L'infezione si verifica quando i topi ingerire pezzi di contamminato cibo, un processo che è non-traumatica, e non richiede competenze specialistiche da investigatori laboratorio. Per un periodo discreto di tempo (36-48 ore), L. monocytogenes riproducibile colonizzano solo il tratto gastrointestinale, permettendo così studiare i meccanismi utilizzati dai patogeni Listeria di traslocare attraverso la mucosa intestinale e diffondere ai tessuti periferici. Importante, il modello può essere utilizzato per studiare differenze ospitante innata resistenza alle infezioni. In un precedente studio, abbiamo dimostrato che BALB / c / da / J topi sono stati molto sensibili al cibo listeriosi Borne, con la replica esponenziale di L. monocytogenes che si verificano nello stomaco, milza, fegato e cistifellea 16. In contrasto, C57BL / 6 topi erano resistenti alle infezioni di origine alimentare, con solo colonizzazione transitoria di L. monocytogenes verificano in ciascuno di questi tessuti. Una caratteristica supplementare del modello di origine alimentare che imita da vicino la malattia umana è che la diffusione naturaleal cervello verificato durante le ultime fasi di infezione (5-7 dpi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di Selective Agar media (BHI / L + G) per inibire microbiota intestinale
- Pesare 26 g di Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g di LiCl e 5,0 g di glicina e posto in un pallone da 1 litro. Aggiungere 500 ml di acqua deionizzata.
- Calore su un agitatore magnetico fino a quando le bolle di agar, mescolando continuamente. Prendete il pallone fuori dal fuoco, lasciare che le bolle si depositano brevemente, e poi riportare a bollore.
- . Autoclave per 30 minuti a 121 ° C sotto 16-19 psi su un ciclo di liquido Nota: lasciare l'ancoretta nel pallone.
- Equilibrare i media a 55 ° C in un bagno d'acqua o lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Non lasciare che la soluzione per ottenere più fredda di 55 ° C o cristalli formeranno nel agar. I cristalli non inibiscono L. crescita monocytogenes o influenzare le proprietà selettive dei media. Tuttavia, i cristalli saranno simili in apparenza a piccole colonie e renderà difficile la conta batterica CFU.
- Mescolare delicatamente ilagar per 1 min con un agitatore magnetico. Evitare la formazione di bolle d'aria. Versare l'agar in piastre di Petri (~ 25 ml / piastra).
Nota: Questo supporto non supporta la crescita di tutti L. monocytogenes. Per esempio, L. monocytogenes EGDE cresce bene su questo terreno, con colonie visibili entro 36-48 ore, ma 10403s non cresce su questo supporto.
2. Preparazione dell'inoculo
- Tagliare il pane bianco a fette (Kroger) in piccolo (2-3 mm) cubi utilizzando sterile forbici Ora bisturi sterile. Non utilizzare le croste. Memorizzare singoli pezzi in provette da microcentrifuga a -20 ° C fino al giorno dell'infezione.
- Usando un bisturi sterile, tagliare piccole (0,5-1 cm), pezzetti di burro salato (Kroger) e mettere ciascuno in una provetta sterile. Ogni tubo conterrà abbastanza burro per preparare 50-60 pezzi di pane. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Grow L. monocytogenes in brodo BHI agitazione a 30 ° C finché la coltura raggiunga un OD 600 di ~ 0.8-1.0. Preparare 500 microlitri aliquote in provette da microcentrifuga, avendo cura di vortice del campione spesso così tutti i tubi contengono lo stesso numero di batteri. Conservare a -80 ° C.
- A titolo le aliquote batteriche, scongelare una provetta in ghiaccio, quindi aggiungere 500 microlitri di 9.5 ml di brodo BHI. Incubare per 1.5 ore in piedi a 30 ° C. Diluizioni seriali piastra su BHI agar. Aspettatevi un titolo di ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml. Nota: Se aliquote omogenee sono preparati, possono aspettarsi ciascuno dei tubi di cedere questo titolo quando preparato in modo simile, con una variazione di 2-4 volte.
- Per infettare i topi, preparare una aliquota di L. monocytogenes come descritto al punto 2.4. Circa 20 minuti prima che la L. cultura monocytogenes è pronto, scongelare i pezzi di pane a temperatura ambiente. Fondere una aliquota di burro a 55 ° C e pre-riscaldare un piccolo volume di PBS a 55 ° C. Preparare pezzi abbastanza pane modo che vi sia almeno una per topodi essere infetti e almeno un pezzo extra per la determinazione del titolo dell'inoculo effettivo.
- Sulla base del titolo predeterminata della aliquota batterica, calcolare il volume totale di L. cultura monocytogenes necessari per preparare il inoculi per il numero di pezzi di pane. I pellet batterico centrifugando a 14000 g per 10 minuti Aspirare tutto il brodo BHI e risospendere i batteri in un piccolo volume di pre-riscaldato PBS (2 ml / pane pezzo).
- Vortex il burro fuso, aggiungere ai batteri (con un volume totale pari a 3 ml / pane pezzo) e mescolare accuratamente. Nota: Non tentare di preparare più di 10-15 pezzi di pane in un momento o il burro si solidifichi.
- Lavorando velocemente, pipetta 5 ml della sospensione batterica in un unico pezzo di pane in una provetta da microcentrifuga. La soluzione deve essere completamente assorbito dal pezzo di pane.
- Per determinare il titolo effettivo dell'inoculo, aggiungere 1 ml di PBS sterile a una delle piec panees. Vortex vigorosamente per 1 min. Preparare diluizioni seriali e piastra sia BHI e BHI / L + G agar.
- Procedura alternativa per l'alto titolo (> 10 9 CFU) inoculi. Se il pellet batterico è troppo grande, può essere difficile per sospendere in un piccolo volume tale, e il materiale risultante è molto viscoso, come una pasta, e alcune delle inoculo può aderire alle pareti della provetta. In questo caso, è meglio inoculare il pane in un piatto di coltura 60 millimetri sterile, e per offrire l'intera piastra (senza il coperchio) al mouse (vedere sotto). Qualsiasi inoculo eccesso che non viene assorbito dal pane può poi essere mangiato direttamente dal mouse. In generale, ci vuole più tempo per i topi da mangiare tutto il pane e leccare il piatto pulito rispetto al protocollo standard descritto di seguito, quindi questo è solo il metodo preferito quando si tratta di altissima inoculi titolo.
3. L'infezione di topi
- Acquisto femmina BALB / c / da / J (stock # 0.010.026) e C57BL/6/J (magazzino# 000644) da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e utilizzare a 6-9 settimane di età.
- Velocemente i topi un giorno (24 ore) prima dell'infezione rimuovendo il cibo e mettendo i topi su (1 pollice) pavimentazione filo sollevata (# 3 mesh; Allentown) per prevenire coprofagia. Lasciare solo biancheria da letto abbastanza nella gabbia di assorbire l'urina, ma non abbastanza per elevare feci capannone. Consentire l'accesso illimitato all'acqua.
- Infettare i topi al momento della comparsa del ciclo di buio, lavorando in una cappa a flusso laminare equipaggiato con una lampadina rossa. Trasferire un singolo mouse per un (non letto) gabbia vuota. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il pezzo pane contaminato al fondo della gabbia vuota. In genere, il mouse prendere il pezzo di pane e consumarlo interamente all'interno di 2-10 min. Se il topo non mangia il pane subito, restituire la gabbia a rack e lasciare il mouse indisturbato per 20-30 min. La maggior parte degli animali si mangia il pane in questo lasso di tempo, tuttavia, i topi possono essere lasciati indisturbati, senza accesso a otil suo cibo o acqua per un massimo di 2 ore.
- Dopo l'infezione, restituire il mouse per la sua gabbia originale e ricostituire il mouse chow. Continuare ad ospitare i topi a filo pavimento sopraelevato per la durata dell'esperimento.
4. Monitorare il livello di batteri Capannone nelle feci
- Tubi etichette e pre-pesare microcentrifuga da utilizzare per la raccolta di feci.
- Lavorare rapidamente dopo il recupero di una gabbia di topi, posizionare ogni mouse in un bicchiere da 500 ml di plastica. In genere i topi espellere 1-4 palline di feci entro 5 min.
- Utilizzare una pinza sterile per trasferire le feci di provette.
- Pesare ogni tubo e calcolare il peso delle feci sottraendo il peso del tubo vuoto. Pesi tipici per pellet fecali vanno da 10-30 mg.
- Aggiungi PBS in ogni provetta (200 μl/30 feci mg) e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per schiacciare le palline fecali.
- Vortex ogni provetta per 30 secondi, quindi preparare diluizioni seriali e piastra su BHI / L+ G agar. Contare il numero di colonie e calcolare CFU / mg di feci.
5. Lavorazione dei tessuti intestinali infetti
- Euthanize i topi, in modo asettico raccogliere lo stomaco e l'intestino da ogni mouse come un unico tessuto e raccogliere in vuote 100 millimetri Petri.
- Separare il piccolo intestino, cieco e del colon e del luogo in separati 60 millimetri piatti memorizzati sul ghiaccio. Il piccolo intestino possono essere ulteriormente divise per lunghezza in tre parti uguali approssimano il duodeno, digiuno e ileo per facilitare la rimozione del contenuto luminale. I terzi di tessuti possono poi essere elaborati sia insieme (per CFU per intero intestino tenue) o separatamente. Tessuti bagnati con ~ 0,5 ml di PBS sterile per mantenere flessibili e prevenire rotture durante la movimentazione.
- Riempire una siringa da 10 ml con 8 ml di PBS sterile e inserire un ago da 25 g. Utilizzare pinze sterili per spremere il contenuto luminale in un bicchiere da rifiuti (o di una sterile tubo da 50 ml, se la raccolta dei batteri luminali). Influenzeh 4 ml di PBS attraverso una delle estremità del tessuto, utilizzare la pinza di spremere il contenuto, e poi capovolgere il tessuto sopra e ripetere dall'altra parte.
- Per quantificare il numero di Listeria nei contenuti luminale, centrifugare le vampate in pool per 20 minuti a 12.000 xg, sospendere il pellet in 0,5-1,0 ml di acqua sterile.
- Per quantificare il numero complessivo di importo associato alle cellule Listeria, aprire ogni tessuto lavato tagliando longitudinalmente con lama di bisturi sterile, e poi fare diversi tagli laterali per affettare il tessuto in frammenti più piccoli. Nota: questo passaggio è essenziale per garantire che il tessuto intestinale non avvolgere la lama omogeneizzatore. Trasferire i pezzi intestinali per un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 2 ml di acqua sterile.
- Sterilizzare un omogeneizzatore tessuto (Fisher PowerGen 1000) posizionando la sonda in 70% di etanolo al 60% di potenza per 30 sec. Attendere etanolo asciugare all'aria o processo in acqua sterile per 10 sec. Omogeneizzare ogni TISSUE per 1 min. Ripetere il trattamento con acqua sterile tra ciascun campione, e utilizzare il 70% di etanolo tra gruppi campione.
- Preparare diluizioni seriali di ogni campione in acqua sterile e piatto su BHI / L + G agar.
6. Elaborazione di infetti linfonodi mesenterici
- Harvest linfonodi asetticamente, posto in una sterile 60 millimetri piatto sul ghiaccio e utilizzare pinza sterile per rimuovere tutto il grasso attaccato. Aspettatevi di trovare 3-6 nodi per mouse.
- Preparare schermi di rete metallica, tagliando 1,5-2 pezzi pollice quadrato di acciaio inossidabile # 80 mesh. Fare un piccolo taglio in ogni angolo, e ripiegare i quattro lati, creando un letto rialzato. Immergere in etanolo al 95% e poi fiamma per sterilizzare, e posto in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 0,75 ml di acqua sterile. Dopo ogni uso, le schermate possono essere riciclati da una immersione in etanolo al 70% per 20 minuti, strofinare con una spazzola per rimuovere i tessuti incorporati, bollire per 20-30 minuti in NaOH 2N, e poi risciacquo con abbondante acqua.
- Utilizzare lo stantuffoda una sterile siringa da 3 ml per schiacciare i nodi attraverso lo schermo di maglia. Assicurarsi di spingere verso il basso sullo schermo per il fondo del piatto in modo che rende contatto con l'acqua nel piatto.
- Passare 0,75 ml di acqua sterile attraverso lo schermo e poi pipetta su e giù diverse volte per sciacquare lo schermo. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta.
- Vortex ogni campione vigorosamente per 30 sec per lisare le cellule. Preparare diluizioni seriali e piastra su entrambi BHI / L + G agar.
7. Elaborazione di Milze infetti, fegato, cistifellea e
- Afferrare milza con pinza sterile e liberare praticando due tagli, uno ad ogni estremità. In un tubo da 15 ml contenente 2,5 ml di acqua sterile. (Nota: i tubi con fondo tondo può essere più facile da usare con l'omogeneizzatore.)
- Individuare la cistifellea (un piccolo giallo sacco pieno di liquido attaccato al fegato) e tagliare accuratamente con le forbici sterili a staccarsi dal fegato senza scoppiare. Trasfer in una provetta contenente 1 ml di acqua sterile.
- Asetticamente rimuovere il fegato, avendo cura di rimuovere tutti i lobi, e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 2,5 ml di acqua sterile.
- Omogeneizzare milze e fegati come descritto sopra per 30 secondi sul potere 60%. Vesciche Forgall, usano forbici sterili per lacerare in provetta, e poi mescolare vigorosamente nel vortex per 30 sec.
- Preparare diluizioni seriali e piastra ogni campione su entrambi BHI o BHI / L + G agar.
8. Lavorazione dei cervelli infetti
- Operando dal lato posteriore del mouse, tagliare la pelle e il tessuto sopra il collo, e attraverso entrambe le orecchie con un angolo di 45 °. Utilizzare una pinza sterile per staccare il lembo a forma di U di pelle tirando verso il naso ed esporre il cranio e delle ossa facciali.
- Immobilizzare il cranio tenendo la cresta ossea tra gli occhi con una pinza, e usare le forbici per fare tagli poco profondi attraverso i bordi laterali del cranio. Essereattenzione a tagliare solo l'osso e non il tessuto cerebrale. Quindi, tagliare la cresta ossea tra gli occhi. Utilizzare una pinza per tenere la parte superiore del cranio e tirare all'indietro (verso il collo) per esporre il cervello.
- Sollevare delicatamente il cervello dalla sua cavità utilizzando una pinza sterile e posto in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 1,5 ml di acqua sterile.
- Omogeneizzare per 20 sec a potenza il 60% come sopra descritto. Preparare diluizioni seriali e piastra su entrambi BHI o BHI / L + G agar.
9. Procedura supplementare: Frazionamento di tessuti intestinali
9.1 Isolamento di batteri nella Frazione Muco
- Per ogni tessuto intestinale, preparare 3 provette contenenti 3 ml di 6 mm N-acetilcisteina (NAC; Sigma # A-9165).
- Posizionare il arrossato e longitudinalmente tagliare i tessuti nel primo tubo per 1-2 minuti, rimestando vigorosamente ogni 20-30 sec. Utilizzando pinze sterili, prelevare il tessuto e premere delicatamente contro la parete della provetta per rimuovere l'eccesso di sapone liquidid.
- Ripetere il punto 9.1.2 altre due volte utilizzando i restanti tubi di NAC. Rimuovere il tessuto intestinale e mettere da parte per ulteriori elaborazioni.
- Piscina la NAC lava (complessivamente 9 ml), e centrifugare per 20 minuti a 12.000 x g.
- Risospendere il pellet in acqua sterile, vortex per 30 sec, preparare diluizioni seriali e piastra su BHI / L + G.
9.2 Isolamento di batteri nella cellula epiteliale (CE) Frazione
- Tagliare ogni tessuto in piccoli pezzi con le forbici sterili e posto in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di RPMI (Invitrogen # 21870) supplementato con 5% di FBS (RP-5), 5 mM EDTA, e 1 mM DTT. Incubare agitazione a 37 ° C per 20 min.
- Trasferire i pezzi intestinali in una nuova provetta contenente 5 ml RP5/EDTA/DTT e incubare agitazione a 37 ° C per 20 min. Salvare il supporto dal primo tubo e mettere da parte a 37 ° C. Ripetere questo processo una volta di più, per un totale di tre 20 min incubazioni in RP5/EDTA/DTT. In caso di procedere alla lamina propria isopasso lamento, trasferire i pezzi rimanenti intestinali in vuoto tubo da 50 ml.
- Unire i tre lavaggi RP5/EDTA/DTT (volume totale di 15 ml) e centrifugare a bassa velocità (1.200 xg) per agglomerare le cellule.
- Per quantificare i batteri extracellulari, raccogliere il surnatante e centrifugare per 20 minuti a 12000 x g. Risospendere il pellet in 0,5-1,0 ml di acqua sterile e diluizioni seriali piastra su BHI / L + G agar.
- Per enumerare i batteri intracellulari, risospendere il pellet CE in 5 ml di RP-5 contenente 25 mg / ml di gentamicina. Incubare la sospensione singola cella per 30 min a 37 ° C più il 7% di CO 2 per uccidere qualsiasi residuo extracellulare L. monocytogenes. Lavare le cellule due volte in PBS, sospensione in 0,5 ml di acqua sterile, e vortex per 30 sec per la lisi delle cellule. Preparare diluizioni seriali in acqua e piastra su BHI / L + G.
Nota: le cellule raccolte in questa fase saranno inoltre contenere cellule di placche di Peyer sottostante. Se lo si desidera, il Peyer visibile èCerotti possono essere rimossi dai tessuti intestinali prima del lavaggio e taglio longitudinale.
9.3 Isolamento di batteri nella lamina propria (LP) Frazione
- Risciacquare l'eccesso DTT / EDTA dai pezzi intestinali aggiungendo 25 ml di PBS sterile al tubo. Agitare energicamente, trasferire in una nuova provetta e ripetere due volte.
- Trasferire i pezzi intestinali in una provetta da 50 ml contenente 4 ml di soluzione di digestione costituito RP-5 supplementato con 1 mg / ml di collagenasi di tipo IV e 40 mcg / ml DNasi I. Incubare agitazione a 37 ° C per 40 min.
- Trasferire i pezzi non digerito in una nuova provetta contenente 4 ml di soluzione di digestione e ripetere una o due volte finché i pezzi di tessuto sono completamente digeriti. Salvare ciascuna delle soluzioni di digestione, che contengono cellule LP liberate, a 37 ° C.
- Centrifugare le soluzioni di digestione di un pool a bassa velocità (1.200 xg) per agglomerare le cellule. Elaborare il surnatante e il pellet cellulare separatamente come described sopra per enumerare i batteri extracellulari e intracellulari, rispettivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L. monocytogenes le colonie saranno visibili su piastre di BHI / L + G, dopo 36-48 ore di incubazione a 37 ° C. Le colonie hanno una, a forma di cupola aspetto bianco cremoso liscia (Figura 1A). Crescita sarà inibito per la maggioranza della flora batterica intestinale, ma è comune vedere alcune colonie che non sono L. monocytogenes, in particolare quando placcatura tenue o del colon senza diluizione significativa (Figura 1B). Colonie sospette possono essere confermate con placcatura in CHROMagar TM piastre Listeria. L. monocytogenes appaiono come colonie blu circondate da un alone bianco su queste piastre (Figura 1C). Il limite di rilevazione per L. monocytogenes in ogni tessuto dipende dal volume di acqua utilizzata per omogeneizzare il tessuto. I volumi di campione indicati nella tabella 1 rappresentano il volume minimo necessario per elaborare efficacemente ogni tessuto. Omogenati di milza, gtutti vescica, cervello o tessuto intestinale frazionati possono essere conservati a 4 ° C per 1-2 giorni e ri-piastrate se necessario. Colon, dell'intestino tenue o omogenati di fegato possono inibire alcuni L. crescita monocytogenes meno che campione viene diluito sufficientemente (Figura 1D), e queste omogenati non cede simili CFU conta se ri-plated dopo conservazione a 4 ° C.
Abbiamo precedentemente dimostrato che BALB / c / da / J (BALB) topi erano significativamente più sensibili al cibo listeriosi borne di C57BL / 6 (B6) topo 16. Un inoculo di 10 7 CFU è sufficiente a stabilire un'infezione intestinale nei topi BALB, ma almeno 10 8 UFC è necessaria per colonizzare il tratto gastrointestinale di topi B6 (Figura 2). Come mostrato in Figura 2, la carica batterica nell'intestino, milza, fegato e cistifellea sarà proporzionale alla dose sfida dato ai topi. Studi preliminari suggeriscono che 5 x 10 9 CFU èl'approssimativa LD 50 per BALB / c / da / J topo, utilizzando questo modello 16.
Figura 1. Rappresentante crescita di colonie su piastre di agar selettivi. A) L. monocytogenes le colonie dopo 48 ore di crescita in BHI / L + G agar. B) BHI / L + G agar inibisce la crescita della maggior parte microbiota intestinale, ma alcune colonie non Listeria (freccia) può essere osservata a basse diluizioni. La piastra di agar qui illustrato contiene 100 pl di una diluizione 10 -1 sulla metà piastra, e 50 microlitri ciascuno dei 10 -2 e -3 10 diluizioni di un omogenato colon. C) L. monocytogenes le colonie possono essere confermate dalla crescita su Chrom piastre di agar Listeria. L. monocytogenes appaiono blu con un alone bianco che circonda la colonia. D) Non è raro see una inibizione di L. crescita monocytogenes, con conseguente colonie di varie dimensioni, nella bassa diluizione o intestinale o omogenati di fegato piastre su BHI / L + G agar.
Figura 2. Dose risposta di infezioni di origine alimentare in BALB / c / Al / J e C57BL / 6 topi. Femmina BALB / c / Al / J (BALB) e C57BL / 6 (B6) i topi sono stati infettati con 10 9 (n = 7), 8 10 (n = 8), 10 7 (n = 6) e 10 6 (n = 4) Lm INLA m ed il numero di CFU in ogni tessuto è stata determinata 5 dpi. Valori di media + / - SD sono mostrati. I dati raccolti da due diversi esperimenti sono stati analizzati. Le linee tratteggiate indicano il limite di rilevazione in ogni organo.
| Tissue | Volume del campione (ml) di un | Limite di rilevazione (CFU) |
| Intestino tenue | 2.0 | 50 |
| Cieco | 2.0 | 50 |
| Colon | 2.0 | 50 |
| Linfonodi mesenterici | 1.5 | 15 |
| Milza | 2.5 | 50 |
| Fegato | 2.5 | 50 |
| Cistifellea | 0.5 | 10 |
| Cervello | 1.5 | 15 |
Tabella 1. Limite di rilevazione per L. monocytogenes in omogenati di tessuto. un volume di campione totale medio composto di acqua sterile, più il tessuto omogeneizzato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Topi inbred non sono uniformemente ricettivi a nutrire in ogni momento della giornata, e la loro volontà di mangiare il pane contaminato dipenderà sia dal tipo di ceppo e l'età dei topi 17. Nella nostra esperienza, 6-9 settimane di età B6 topi sono ricettivi per l'alimentazione in ogni momento della giornata, ma i topi BALB non sempre mangiare il pezzo di pane a meno che non viene offerto durante il loro ciclo di buio. Il ciclo di luce della stanza utilizzata per ospitare gli animali può essere alterata in modo che la fase di buio coincide con il giorno normale di lavoro per il personale di laboratorio. Tuttavia, i topi devono essere somministrati almeno due settimane per acclimatarsi al ciclo di luce alterata prima dell'infezione. Durante l'infezione, solo lampade rosse dovrebbero essere utilizzati sia nella stessa camera o nella cappa a flusso laminare.
Nello sviluppo di questo modello, pane è stato scelto come fonte di cibo per trasmettere L. monocytogenes in gran parte perché il pane è assorbente. Così, è stato facile per saturare piccoli pezzi con the inoculo batterico e assicurarsi che ogni topo ingerito la stessa dose. Tuttavia, questo modello potrebbe facilmente essere adattato per utilizzare altre fonti di cibo. Infatti, questo è l'unico modello di topo che può essere usato per testare direttamente l'effetto della composizione alimentare o le condizioni di stoccaggio su infettività batterica. L. monocytogenes può facilmente adattarsi alla crescita in alto sale, pH basso, oa temperature fredde 1,2,18, ma non è noto se tali condizioni di crescita alterano la capacità dei batteri di stabilire infezione intestinale.
Circa 10 min è necessaria per raccogliere tutti gli organi infetti da un singolo topo. La cistifellea è facilmente rotto, quindi è consigliabile rimuoverla prima. I linfonodi mesenterici sono più facili da individuare quando non sono stati disturbati l'intestino, quindi dovrebbero essere rimossi dopo. L'intestino può essere raccolto come un unico tessuto, tagliando appena sotto lo stomaco e appena sopra l'appendice, e poi separati in duodeno, digiuno, ileum, cieco, colon e appena prima di lavaggio e omogeneizzazione. Milza e del fegato sono tipicamente rimossi successivo, e il cervello viene raccolto dopo recuperato organi dalla cavità peritoneale, in quanto è necessario ruotare il mouse per accedere al cranio. Quando si lavora con più topi, tutti i tessuti dovrebbero essere conservati in ghiaccio fino elaborati. Per la maggior parte dei tessuti, una piastra di agar è stato utilizzato per determinare il numero totale di CFU presente nel tessuto. La piastra è stata divisa in tre parti, e un campione di 50-100 microlitri di tre diluizioni separate del tessuto omogenato è stato placcato su ogni terzo.
I metodi qui descritti identificano il numero totale di L. monocytogenes in ogni tessuto del mouse, non solo gli organismi intracellulari. L'unico stile di vita intracellulare di L. monocytogenes è pensato per essere una determinante chiave virulenza durante l'infezione 18,19. Tuttavia, L. monocytogenes sono facoltativi, non obbligati, patogeni intracellulari, e there sono rapporti pubblicati definitive per indicare la percentuale di Listeria che effettivamente risiedono all'interno delle cellule in vivo. Maggior parte degli studi precedenti utilizzando L. orale infezione monocytogenes invocato trattamento gentamicina dei tessuti intestinali di inibire la crescita di microbiota intestinale. Pre-trattamento con gentamicina ha il potenziale per eliminare extracellulare L. monocytogenes, consentendo il recupero solo i batteri intracellulari, anche se non è chiaro in che misura gentamicina è in grado di penetrare i tessuti interi intestinali in vitro. Il protocollo supplementare qui descritto permette di determinare sia i batteri extracellulari ed intracellulari nello strato di muco, l'epitelio e la lamina propria del vano tessuti intestinali infetti. In questa procedura, la gentamicina è usato per trattare sospensioni di cellule singole, garantendo che tutti i batteri sono stati recuperati all'interno delle cellule all'interno del tessuto.
Tre lavaggi con NAC tipicamente rispostato la maggior parte del muco dai tessuti intestinali, ed i lavaggi in pool non contengono cellule eucariote (vitali o morti), come determinato da blu tripano colorazione. Lavaggi aggiuntivi non producono muco visibile, come determinato dal Diff-Quik colorazione di vetrini preparati cytospin. La cellularità del CE e LP frazioni può anche essere confermata utilizzando Diff-Quik o Giemsa. La frazione CE deve essere composto da cellule epiteliali, in primo luogo, che può facilmente essere distinti dai pochi linfociti intraepiteliali presenti nell'epitelio intestinale. La frazione LP è più varia, contenente una miscela di cellule mononucleate che cambia composizione dopo l'infezione quando monociti infiammatorie infiltrano il tessuto.
Il modello di origine alimentare listeriosi può essere utilizzato con una varietà di L. monocytogenes isolati, tra cui il topo-adattato INLA m-esprimendo ceppo 15 qui descritto, tipo EGDE selvaggio, e la cancellazione mutante derivati di questi ceppi 16. In un precedente studio, abbiamo dimostrato che il livello di colonizzazione intestinale non variano in modo significativo tra questi ceppi, tuttavia, gli isolati che non hanno espresso una elevata affinità per il ligando murino E-caderina avuto un lieve difetto di diffusione ai linfonodi mesenterici e milza 16. Analogamente, qualsiasi ceppo mouse può essere utilizzato per l'infezione, rendendo questo un sistema modello attraente per studiare sia patogenesi batterica e risposte a infezione ospitante. Infine, anche se non abbiamo ancora testato questo direttamente, proponiamo che le procedure di base utilizzate qui dovrebbero essere ampiamente applicabile ad altri batteri patogeni alimentari sostenuti e quali Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter e specie Citrobacter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Tutti gli esperimenti descritti qui sono stati eseguiti in conformità con l'Ufficio per Laboratorio Animal Welfare (OLAW) con l'approvazione del ICAUC presso l'Università del Kentucky.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (AI079442 e AI091918) assegnati a SEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
