Oral Overføring av<em> Listeria monocytogenes</em> I Mus via Inntak av forurenset mat

Summary

Dette dokumentet beskriver en ny fremgangsmåte for oral infeksjon av mus ved anvendelse av<em> Listeria monocytogenes</em>-Forurenset mat. Protokollen kan lett tilpasses for bruk med andre matbårne bakterielle patogener.

Abstract

L. monocytogenes er fakultative intracellulære bakterier som forårsaker matbårne infeksjoner hos mennesker. Svært lite er kjent om gastrointestinal fase av listeriose på grunn av mangel på et lite dyr modell som etterligner sykdom hos mennesker. Dette notatet beskriver en roman musemodell for muntlig overføring av L. monocytogenes. Ved hjelp av denne modellen, mus matet L. monocytogenes-forurenset brød har en diskret fase av gastrointestinal infeksjon, etterfulgt av varierende grad av systemisk spredning hos følsomme (BALB / c / Av / J) eller resistente (C57BL / 6) musestammer. I løpet av de senere stadier av infeksjonen, er formidling til galleblæren og hjerne observert. Den matbårne modell av listeriosis og reproduserbar, krever ikke spesielle ferdigheter, og kan brukes sammen med et bredt spekter av bakterielle isolater og laboratorie musestammer. Som sådan, er det den ideelle modellen til å studere både virulens strategier som brukes av L. monocytogenes </em> å fremme intestinal kolonisering, samt vertsrespons til invasiv mat bæres bakteriell infeksjon.

Introduction

Listeria monocytogenes er fakultative intracellulære bakterier som forårsaker matbårne infeksjoner hos mennesker. Bakteriene er resistente mot mange av de prosessene som brukes til å beskytte vår matforsyning, som tørking, salting, eller kjøling ^1,2 og infeksjoner er vanligvis knyttet til bearbeidet, "ready-to-eat" mat som ikke er oppvarmet før konsum . I flere tidligere utbrudd, kilden til L. monocytogenes-forurenset mat ble identifisert, og begrenset gruppe av eksponerte individer ble overvåkes nøye ^3-6. I disse eksemplene, klinisk sykdom hos ellers friske individer varierte fra en mild, selvbegrensende gastroenteritt til mer alvorlige tarm og systemiske infeksjoner som krevde sykehusinnleggelse. L. monocytogenes infeksjoner i svekket immunforsvar individer, inkludert både nyfødte og eldre, har vært forbundet med høy dødelighet (25-30%), selv med antibiotikabehandling <sopp> 7,8. Lite er kjent om den smittsomme dose for L. monocytogenes, eller verten faktorer som styrer mottakelighet for infeksjon etter muntlig overføring, hovedsakelig på grunn av mangel på et lite dyr modell som sammenfatter dette brede spekter av infeksjon utfall.

Den mest brukte modell av listeriosis er intravenøs (iv) inokulering av mus. Den iv modellen er svært reproduserbare, og har vært svært nyttig for å studere både naive og hukommelse T celle responser under infeksjonen ^9,10. Ulempen med iv modellen er at den helt omgår intestinal fase av infeksjonen. Etter matbårne overføring, gir tarmslimhinnene en barriere som formodentlig bremser og begrenser antallet bakterier som kan kontinuerlig formidler til perifert vev. I motsetning, kan hele podestoff bli funnet i milten og leveren innen minutter IV-administrering, og denne store bolus av organismer kan overvelde medfødt immun defenses i disse vev. Oral infeksjon av mus ved gavage er mindre vanlig brukt, fordi store doser (10 ⁹ -10 ¹¹ CFU) er vanligvis nødvendig for å oppnå kolonisering intestinal ^10.. Også gjør magesekken (ig) inokulering med en fôring nålen ikke generere en reproduserbar periode med gastrointestinal infeksjon før systemisk spredning. Noen laboratorier har rapportert at L. monocytogenes nå milt og lever innen 4-12 timer etter infeksjon (HPI), mens andre viste ingen systemisk spredning inntil 48 HPI ^11-15. Denne lab-til-lab variasjon kan være en konsekvens av invasiv art ig inokulasjon, noe som kan føre til mindre traume til slimhinnen i spiserøret, og fremme direkte blodet invasjon av bakterier.

Vi har nylig utviklet en ny musemodell av oral L. monocytogenes infeksjon som etterligner alle faser av menneskelig sykdom ^16. Infeksjon oppstår når musene får i stykker av contaminerte mat, er en prosess som er ikke-traumatisk, og krever ikke spesielle ferdigheter ved laboratorie undersøkere. For en diskret tid (36-48 timer), L. monocytogenes reproduserbart kolonisere kun mage-tarmkanalen, noe som tillater undersøkelse av de mekanismene som brukes ved patogene Listeria å translocate over tarmslimhinnene og spre til perifere vev. Viktigere, kan modellen brukes til å studere forskjeller i verten medfødt motstand mot infeksjon. I en tidligere studie viste vi at BALB / c / Av / J mus var svært utsatt for matbårne listeriose, med eksponentiell replikering av L. monocytogenes som forekommer i tarmen, milt, lever, galleblære og ^16.. I kontrast var C57BL / 6 mus resistente overfor matbårne infeksjon, med bare forbigående kolonisering av L. monocytogenes som forekommer i hvert av disse vev. En ekstra funksjon i matbårne modell som etterligner menneskelig sykdom er at naturlig formidlingtil hjernen skjedde under de senere stadier av infeksjonen (5-7 dpi).

Protocol

En. Utarbeidelse av selektiv agar Media (BHI / L + G) for å hemme tarmfloraen Vei opp 26 g hjerne hjerte infusjon Agar (Difco), 7,5 g LiCl og 5,0 g glycin og plasser i en 1 liters kolbe. Tilsett 500 ml med avionisert vann. Varme på en magnetrører inntil agar koker, kontinuerlig omrøring. Ta flasken av varmen, la boblene bosette kort stund, og deretter bringe tilbake til en byll igjen. . Autoklav i 30 minutter ved 121 ° C under 16-19 psi på en væske syklus Merk: La r…

Representative Results

L. monocytogenes kolonier vil være synlig på BHI / L + G plater etter 36-48 timers inkubasjon ved 37 ° C. Koloniene har en glatt, kuppelformet kremaktig hvitt utseende (figur 1A). Veksten vil være hemmet for flertallet av tarmfloraen, men det er vanlig å se noen kolonier som ikke L. monocytogenes, særlig ved plating tynntarmen eller kolon direkte uten vesentlig fortynning (figur 1B). Mistenker kolonier kan bekreftes ved platekledning på CHROMagar TM <…

Discussion

Innavlede mus er ikke jevnt mottakelig for fôring til alle tider av døgnet, og deres vilje til å spise forurenset brød vil avhenge både av belastningen type og alder av musene ^17. Vår erfaring er 6-9 uker gamle B6 mus er mottakelige for fôring når som helst på dagen, men BALB mus vil ikke konsekvent spise brød stykke med mindre det blir tilbudt i løpet av sin mørke syklus. Den lyssyklus av rommet før huset dyr kan bli endret slik det mørke fase faller sammen med den normale arbeidsdag for labora…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22