Vi introduserer en protokoll for generering av store tall (tusen til flere hundre tusen) med lik størrelse-og komposisjonsstyrt svulst sfæroider, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige mikroplater.
Tumor sfæroider blir stadig mer anerkjent som en viktig in vitro-modell for oppførselen av tumorceller i tre dimensjoner. Mer fysiologisk relevant enn konvensjonelle tilhenger-arks kulturer, de er mer nøyaktig rekapitulere kompleksiteten og interaksjoner stede i reelle svulster. For å kunne utnytte denne modellen for å bedre vurdere tumorbiologi, eller effekten av nye terapeutiske midler, er det nødvendig å være i stand til å generere sfæroider reproduserbart, på en kontrollert måte og i et betydelig antall.
Den AggreWell systemet består av en høytetthets matrise av pyramideformede mikrobrønner, i hvilken en suspensjon av enkeltceller ble sentrifugert. Antallet celler clustering på bunnen av hver mikrobrønn, og antallet og forholdet mellom forskjellige celletyper som er involvert avhenger kun av egenskapene til suspensjonen innføres ved experimenter. Dermed er vi i stand til å generere tumor sfæroider av vilkårlig størrelse og sammensetning medut som ønsker å endre den underliggende plattform teknologi. De hundrevis av mikrobrønner per kvadratcentimeter av kultur areal i sin tur sikrer at svært høye produksjonsnivåer kan oppnås via en grei, nonlabor krevende prosess. Vi forventer derfor at denne protokollen skal være bredt nyttig for forskere i svulsten spheroid feltet.
Det er en økende mengde bevis for at kreftceller oppfører seg forskjellig i tredimensjonale kulturer enn de gjør når dyrket på plast, og at terapeutiske midler identifisert på konvensjonelle vev-kultur plattformer kan miste effekt når overført til en mer fysiologisk-relevant system en. Det er derfor ønskelig å studere oppførselen av kreftceller under disse betingelser, både for å få innsikt i den underliggende biologi, og også for å øke den suksessrate på overgangen nye terapeutiske midler fra sikteanlegg til klinikken. Et nyttig modellsystem med en lang historie benytter tredimensjonal klynger av kreftceller er kjent som tumor sfæroider 1,2. Ideelt sett ville teknikker for sfæroide dannelse tillate produksjon av et stort antall sfæroider som har ensartede størrelse og sammensetning er kontrollert av experimenter. Selv om oppheng-slipp og godt platen nærmer seg 3,4 er i stand til å utføre noen av disse rekrav, gjennomstrømning er generelt begrenset, og generering av et stort antall sfæroider blir en arbeidskrevende oppgave.
Vi har nylig utviklet et system for å løse tilsvarende utfordringer i regenerativ medisin feltet fem. Anvendelse av tvungen aggregering i løpet av en rekke tett pakkede mikron stilte brønner (se figur 1), tillater denne metode generering av sfæroider av vilkårlige antall celler, inkludert blandinger av flere celletyper 6, samt inkorporering av forskjellige biomaterialer 7. Sfæroider blir dannet i store mengder – flere tusen til flere hundre tusen eller mer – og kan ekstraheres umiddelbart eller opprettholdt i mikrobrønner i hvilken det er dannet med mellomutveksling for minst ett åtte til to (upublisert observasjon) uker. Dette systemet er derfor godt egnet til produksjon av store mengder uniform og reproduserbare tumor sfæroider for vurderingen av effectiveness av nye antitumor agenter eller grunnleggende biologiske undersøkelser.
Vi har etablert et system der et stort antall ensartede sfæroider kan frembringes fra flere cellelinjer fra forskjellige kilder. Vi har ennå å møte en tilhenger cellelinje som ikke danner sfæroider under disse forholdene. Vi har tidligere observert celle tap i populasjoner utsatt for anoikis 5,8, men til dags dato dette problemet har ikke oppstått med tumor linjer. Systemet er vilkårlig skalerbar med overflateareal, med konsekvent adferd tvers mikrobrønner i 24-brønns-og 6-brønners-formatet, samt prototype bioreaktorer inneholdende 50 000 mikrobrønner hver for tiden under utvikling.
Skulle sfæroide asymmetri være et problem, kan det hende at inkubasjonstiden i trinn 4.8 økes til to eller tre dager. Sfæroider kan også bli inkubert i en periode etter ekstraksjon fra mikrobrønnene for å øke symmetri, men i dette tilfelle forsiktighet må utvises for å holde kulturen tettheter tilstrekkelig lavt, som sfæroider i kontakt med hverandre will ofte smelter sammen i større strukturer. På grunn av dette har vi tidligere opprettholdt kulturer innenfor mikrobrønnene hvor aggregatene ble dannet, med den primære begrensning er størrelsen av den sfæroide. Dette i sin tur er en funksjon av både vekst og opprinnelig størrelse 8, og hvis utvidet kultur innenfor mikroplaten er planlagt, bør dette vurderes på forhånd. Alternativer for å hindre gjengroing, bør det forekommer, er enten starter med mindre sfæroider, eller ansette de større mikro av AggreWell 800 plate.
Skulle sfæroider ikke klarer å øke i koherens over tid, kan en potensiell årsak være celledød. Særlig i større aggregater av meget metabolsk aktive celler, kan massetransport begrensninger på levering av oksygen og essensielle næringsstoffer resultere i en nekrotisk kjerne 2 – således en ikke-kohesiv sfæroide kan ganske enkelt være en konsekvens av overdreven celledød. Alternativt kan målingene av mekaniske sammenhensjon av sfæroider som er blitt brukt for å vurdere intercellulære bindingsstyrker, i forhold til metastatisk potensiale for en gitt cellelinje 13.. Det ville være interessant å undersøke forholdet mellom spheroid form og metastatisk potensial, kanskje ved hjelp av morfometriske parametere som rundhet og omkretsen til området ratio.
I tillegg til å undersøke de mekaniske og morfometriske egenskaper av sfæroider, konfeksjonering i mikrobrønnsystem gjør det mulig i stor skala produksjon av blandet komposisjon sfæroider, som består av kombinasjoner av forskjellige celletyper og / eller biomaterialer 6,7. Vekselvirkningen av tumorceller med andre celletyper som er viktige for nærmere modellere oppførselen av tumorer in vivo 14, og dermed kan det være av interesse for å generere sfæroider fra tumorceller i kombinasjon med fibroblaster og endotelceller, f.eks. Mikropartikler av forskjellige biomaterialer kan også være innarbeidet, og kan påvirke SPHeroid egenskaper både direkte gjennom deres interaksjon med cellene 7,15, og også som reservoar for kontrollert frigjøring av vekstfaktorer og cytokiner i det indre av den sfæroide 16..
Hvis det er noen bekymring om sterilitet, for eksempel når man arbeider med en mikroplate i hvilken noen brønner har tidligere vært brukt, som kan ha blitt brukt en gang i en inkubator som en del av et tidligere eksperiment, brønnene kan steriliseres på nytt med 70% etanol i vann.
Når sfæroider er blitt dannet, kan de også bli separert fra gjenværende unincorporated celler ved å sende suspensjonen over et celle sil. Individuelle celler vil passere gjennom, mens de sfæroider vil bli beholdt. Hvis det er mistanke om den sfæroide av shedding potensielt metastatiske celler i løpet av kulturen, kan det være ønskelig å utføre denne fremgangsmåten flere ganger – først å fjerne unincorporated celler, og senere for å isolere renseded populasjoner av celler som avgis av sfæroider.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Universitetet i Calgary, under en ny etterforsker oppstart stipend til Dr. Ungrin.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |