Summary
يوصف بروتوكول لتسليم ينترادوكتال غير الغازية من الكواشف مائي في الغدة الثديية الماوس. طريقة يستفيد من الحقن الموضعي في الحلمات من الغدد الثديية التي تستهدف القنوات الثديية على وجه التحديد. هذه التقنية قابلة للتكيف لمجموعة متنوعة من المركبات بما في ذلك سيرنا، وكلاء العلاج الكيميائي والجزيئات الصغيرة.
Abstract
هنا نحن تصف بروتوكول لتقديم مختلف الكواشف الغدة الثديية للفأر عن طريق الحقن ينترادوكتال. وكانت العقاقير الموضعية وتدق إلى أسفل من الجينات داخل الظهارة الثديية من الصعب تحقيق ذلك بسبب عدم وجود جزيئات تستهدف المناسبة التي هي مستقلة عن مراحل النمو مثل الحمل والرضاعة. هنا، نحن تصف تقنية لتسليم المترجمة من الكواشف إلى الغدة الثديية في أي مرحلة في مرحلة البلوغ عن طريق الحقن ينترادوكتال في الحلمات من الفئران. الحقن يمكن أن يؤديها على الفئران الحية، تحت التخدير، والسماح لتسليم المخدرات غير الغازية والمترجمة إلى الغدة الثديية. علاوة على ذلك، يمكن تكرار الحقن على مدى عدة أشهر دون الإضرار الحلمة. الأصباغ الحيوية مثل ايفانز الأزرق هي مفيدة جدا لتعلم هذه التقنية. عند حقن ينترادوكتال من الصبغة الزرقاء، يصبح شجرة الأقنية بأكملها مرئية للعين. علاوة على ذلك، الكواشف fluorescently المسمى تسمح أيضا للالتصور والتوزيع داخل الغدة الثديية. هذه التقنية قابلة للتكيف لمجموعة متنوعة من المركبات بما في ذلك سيرنا، وكلاء العلاج الكيميائي، والجزيئات الصغيرة.
Introduction
وتتألف الغدة الثديية الماوس من شجرة الأقنية السنخية المعقدة التي يتقاطع في القناة المركزية في الحلمة. في الفئران، وكذلك البشر، فإن غالبية أورام الثدي تنشأ في الخلايا الظهارية المبطنة لقنوات الحليب. وتشمل العلاجات المتاحة حاليا العلاج الكيميائي عن طريق الوريد، والإشعاع، والجراحة. تم استكشاف علاجات موضعية ينترادوكتال 1-3 وتقدم مزايا كبيرة من حيث انخفاض السمية والآثار الجانبية. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من التحديات أمام هذه يمكن تطبيقها على نطاق أوسع. القدرة على تنفيذ إجراءات مماثلة في الغدة الثديية الماوس يسهل توصيف تدخلات ينترادوكتال. ونحن هنا نقدم وسيلة غير الغازية لتسليم الكواشف مباشرة في الماوس الثديية لاصق.
وقد سبق أن أظهرت تسليم ينترادوكتال من العلاج الكيميائي وكلاء في كل من مرضى سرطان الثدي ونماذج الماوس لتكون فعالة للغاية مع عدم وجود دليل علىسمية جهازية أو التشريحية المرضية على المدى الطويل يغير 3-6. علاوة على ذلك، وقد ثبت أن حقن الخلايا السرطانية وlentiviral تسليم ناقلات الجينات المسرطنة في السابق ليكون ممكنا عن طريق الحقن ينترادوكتال 7-10.
بالإضافة إلى تقديم الأدوية، وهذا الإجراء مفيد لإسكات الجينات المحلية من الغدة الثديية من خلال حقن ينترادوكتال من سيرنا. حقن كميات صغيرة من محلول سيرنا فعالة دون تغيير علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء من الغدة الثديية. في المختبر لدينا أظهرنا مؤخرا إسكات ناجحة من الجينات سيط رئيسي في الفئران المعدلة وراثيا التي تتطور بشكل عفوي الأورام الثديية الناتجة في الوقاية من الأورام التقدم (بروك وآخرون، غير منشورة). كنا قادرين على تكرار الحقن كل أسبوعين في نفس الحلمات تصل إلى 7 مرات في فترات 2 أسابيع مع عدم وجود تلف الأنسجة مرئية أو سمية.
حقن ينترادوكتال يمكن توقيتها في الماوس الكبار لمعالجة جمعةالأحداث opmentally محددة ذات الصلة بالتنمية الغدة الثديية أثناء الحمل والرضاعة، وارتداد أو لاستهداف مراحل لاحقة خلال تطور الورم والتقدم. عذراء الإناث يتجاوزن 8 أسابيع من العمر وقد تم حقن غير جراحية في مختبرنا.
Protocol
1. إعداد حقن الحل
- إعداد 0.2٪ ايفانز صبغة زرقاء في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو غيرها من محلول مائي من الفائدة. هذه الصبغة الحيوية مفيد لتقييم نجاح الحقن ينترادوكتال وينصح كوسيلة مساعدة عند وضع التصور الخبرة في هذه التقنية.
فإن حجم المطلوبة تعتمد على عدد ومواقع الغدد ليتم حقنه. ويمكن حقن كل 10 الغدد الثديية من إناث الفئران ولكن نظرا لحجم الغدة أصغر حجما، وأزواج الغدة 1 و 5 وعادة ما يتم حقن مع 10 ميكرولتر من الحل. يتم حقن كل الأزواج الثديية الأخرى مع 20 ميكرولتر. هذه الكميات تكفي لملء شجرة الأقنية بأكمله.
2. التحضير قبل الجراحة
- تسجيل وزن الجسم كل الماوس. كما هو الحال مع جميع الدراسات قبل السريرية، ينبغي رصد أوزان الحيوانات بانتظام (مرتين في الأسبوع أو أكثر) لتقييم السمية المحتملة.
- تخدير م[أوس] باستخدام غرفة isoflurane وتطبيق مواد التشحيم والعين. أثناء الإجراء سيستمر الفئران أن استنشاق باستخدام تخدير تركيز 2-4٪ من isoflurane والأكسجين في طريق مخروط الأنف. ترصد بدقة الماوس لإجراء تغييرات في معدل التنفس، وتعديل مستوى isoflurane وفقا لذلك.
- حقن ميلوكسيكام (5-10 ملغ / كلغ) تحت الجلد قبل الإجراء وتسكين.
- تطبيق أكثر من وصفة كريم إزالة الشعر إلى منطقة الحلمة. انتظر 5 دقائق وبلطف إزالة الشعر فضفاض مع قضيب من القطن طرف باستخدام حركة دائرية. إزالة كريم باستخدام مناشف ورقية مبللة المبللة بماء دافئ. لا ينصح الحلاقة نظرا لخطر الإضرار الحلمات.
- تأمين الماوس تحت المجسام عن طريق تسجيل بلطف أسفل الأطراف.
- مواقع الحقن النظيفة مع مسحات الكحول.
3. حقن ينترادوكتال
- تحديد موقع الحلمات المناسبة ليتم حقنه تحت المجسام. استخدام غرامة الجزئي تشريح-tweezers لإزالة أي الجلد الميتة التي تغطي افتتاح الحلمة.
- الحمل 10-20 ميكرولتر من محلول الحقن في حقنة 50 ميكرولتر مع 33 G محور إبرة معدنية الملصقة. في بعض الأحيان، وبعد حقن كميات صغيرة (1 ميكرولتر أو أقل) يمكن أن يتسرب من الحلمة عند سحب الإبرة. وبالتالي، فمن المستحسن لحقن 11 أو 21 ميكرولتر على التوالي لحساب الخسارة المحتملة.
- عقد الحلمة برفق مع ملاقط غرامة ورفعه قليلا لوضعه للحقن. فإنه ليس من الضروري لخفض الحلمة.
- حقن المحلول ببطء لتقليل الأضرار المحتملة الناجمة عن التحرك بسرعة السوائل داخل شمعة الأقنية. ينبغي الحفاظ على معدل الحقن في حوالي 40 ميكرولتر / دقيقة.
4. رعاية ما بعد الجراحة
- مراقبة موقع الحقن. ينبغي أن يكون هناك أي علامات للصدمة إلى منطقة الحلمة أو الأنسجة المحيطة بها. تورم في المنطقة المحيطة بالحلمة المرجح يدل على وسادة الثديية الدهون حقن راذهص من حقن ينترادوكتال ناجحة.
- إزالة الحيوان من مخروط الأنف والانتقال إلى قفص منفصل لتحقيق الانتعاش. وضع القفص تحت مصباح الحرارة لمنع انخفاض حرارة الجسم والمساعدة في الانتعاش. ويعيش الفئران منفردة وسيتم مراقبتها عن كثب حتى يستعيد وعيه والتنقل.
5. تحليل الغدة الثديية الأنسجة
- عند الانتهاء من الدراسة، والموت الرحيم الفئران عن طريق خلع عنق الرحم التالية CO 2 الغاز المضغوط في غرفة العزل. يتم استئصال الغدد الثديية، ويمكن استخدامه لإعداد جبل كامل 11، الأنسجة، أو RNA والبروتين العزلة.
Representative Results
الحلمات يمكن أن تكون مترجمة بسهولة باستخدام stereomicroscope مرة واحدة تمت إزالة الشعر في المنطقة المحيطة به (الشكل 1A). لإتقان تقنية الحقن، فمن المستحسن لحقن صبغة زرقاء ايفانز ومراقبة سلامة الغدة (الأرقام 1B و C). هذا النهج يسمح أيضا لتحديد أحجام مناسبة ليتم حقنه في كل غدة واحدة يمكن تقييم ما إذا كان بصريا الصبغة يصل النظام بأكمله الأقنية (أرقام 1C و2A). صورة من حقن ايفانز صورة الأزرق ثم يمكن مقارنة كاملة محمولة على الغدة الثديية، التي اتسخت شجرة الأقنية كامل مع كارمين الشب صبغ (الشكل 2B).
يرجى ملاحظة أن متانة هذه الطريقة حقن تعتمد بشكل كبير على مشغل الشبكة. على سبيل المثال، تثقيب القناة سيؤدي إلى منصة الدهون الثديية الحقن وحقن حل سريع جدا قد يؤدي إلى تلف سل الظهارية الأقنيةليرة سورية وإثارة استجابة التهابية. حقن ينترادوكتال ناجحة يمكن تسليم المخدرات المترجمة إلى الغدة الثديية، ويقلل كثيرا ما لوحظ خلاف ذلك الآثار الجانبية غير محددة.
صورة مثال على الغدة حقنوا الموسومة fluorescently سيرنا استهداف cyclophilin (الجينات غير الضرورية) هو مبين في الشكل (3).
الشكل 1. حقن الغدة الثديية الأربية من خلال الحلمة مع ايفانز صبغة زرقاء. A) مظهر الحلمة قبل الحقن وB) بعد الحقن مع 20 ميكرولتر ايفانز صبغة زرقاء. ويلاحظ أي تورم أو تلف الأنسجة. C) عند فتح الجلد، يسمح الصبغة التصور من شجرة الأقنية الثديية بأكمله.
الشكل 2. كله يشن تحليل ايفانز في الزرقاءالغدة jected. A) قد تم مسح صورة الممثل من غدة تشريح رفعه من الحيوان وانتشرت على شريحة زجاجية مباشرة بعد الحقن. B) كامل تلطيخ جبل من نفس الغدة مع اللون القرمزي بعد صبغ الدهون. مقارنة مع A) يؤكد أن الحل حقن يملأ شجرة الأقنية اللبنية والغدة سليمة تشريحيا.
الرقم 3. تسليم ينترادوكتال من سيرنا الفلورسنت. صورة الممثل من عينة الأنسجة الطازجة ورفعه 48 ساعة تال للحقن.
Discussion
المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران هي أدوات لا تقدر بثمن لدراسة دور الجينات في الجسم الحي الفردية في سرطان الثدي. ومع ذلك، فإنه مكلف وتوليد هذه الحيوانات تستغرق وقتا طويلا وضربة قاضية الجين هو عادة في كل مكان ما يحول دون لنا في بعض الأحيان من التعرف على آثار محددة من هذا الجين على الغدة الثديية. وبالتالي، فإن ضربة قاضية استهدفت تخفيف القضايا من الآثار الجانبية والسميات غير محددة في الأجهزة الأخرى.
حقن ينترادوكتال من سيرنا المعروضة هنا تمكن ضربة قاضية الجينات المترجمة في الماوس الغدة الثديية. بل هو طريقة سريعة لتسليم المخدرات المستهدفة والمترجمة إلى الغدة الثديية لا تقتصر على تسليم سيرنا. مثل هذا الثديية تسليم المخدرات الغدة محددة غير محددة يتجنب الآثار الجانبية والسمية إلى أعضاء أخرى، ويسمح لدراسة التعديلات الجينات في نقطة زمنية محددة خلال التنمية الغدة الثديية وتشكيل الورم الثدي. ليس هناك أي دليل من الاشتراكيةجزيئات الحمض النووي الريبي في الغدد غير حقن، والكبد أو الأجهزة الأخرى التي تقدم دليلا إضافيا على أن يقدم هذا الأسلوب وسيلة مفضلة للالمترجمة ضربة قاضية الجينات في الغدة الثديية. وعلاوة على ذلك، فإن حقن ينترادوكتال يمكن أن تتكرر أسبوعيا أو كل أسبوعين على مدى عدة أشهر للسماح لرصد طويل الأجل من العوامل العلاجية.
هذه التقنية يفتح إمكانية لمعايرة تسليم ينترادوكتال من مختلف الكواشف إلى القنوات الثديية الماوس. يجب التقدم في تسليم المترجمة في نماذج الماوس جيدا اتسم تسريع تطبيق غير الغازية، استهدفت الاستراتيجيات العلاجية في البشر.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم الإفصاحات المالية.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل غولدبرغ لإعداد استقرت حل سيرنا وهيذر توبين لمساعدتها مع الحيوانات. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الدفاع جائزة مبتكر W81XWH-08-1-0659 لDEI. وأيد تدريب ما بعد الدكتوراه من SK من قبل مؤسسة سوزان كومن G (KG101329). فإن الكتاب أود أن أشكر كريستين جونسون لإعداد التخطيطي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
References
- Dooley, W. C., et al. Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer. J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).
- Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. Intraductal therapy for the prevention of breast cancer. Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in mammary gland biology and breast cancer research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/ Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Reddy, J. P., Li, Y. The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. , e2828 (2011).
