Een protocol voor de niet-invasieve intraductale afgifte van waterige reagentia voor de muis borstklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van gelokaliseerde injectie in de tepels van melkklieren targeting mamma-kanalen specifiek. Deze techniek kan worden aangepast voor verschillende verbindingen waaronder siRNA, chemotherapeutische middelen en kleine moleculen.
Hierin beschrijven we een protocol om verschillende reagentia leveren aan de muis borstklier via intraductale injecties. Gelokaliseerde drug delivery en knock-down van genen binnen de borstklier epitheel is moeilijk te realiseren vanwege het ontbreken van adequate targeting moleculen die onafhankelijk van ontwikkelingsstadia, zoals zwangerschap en lactatie zijn. Hierin beschrijven we een techniek voor gelokaliseerde afgifte van reagens aan de borstklier in elke fase van volwassenheid via intraductal injectie in de tepels van muizen. De injecties kunnen worden uitgevoerd op levende muizen, onder verdoving, en zorgen voor een niet-invasieve en gelokaliseerde geneesmiddelafgifte de borstklier. Bovendien kan de injecties herhaald over meerdere maanden zonder de tepel. Vital kleurstoffen zoals Evans Blue zijn zeer nuttig om de techniek te leren. Bij intraductal injectie van de blauwe kleurstof het gehele ductale boom zichtbaar voor het oog. Bovendien fluorescent gelabelde reagentia mogelijk ookvisualisatie en distributie in de borstklier. Deze techniek kan worden aangepast voor verschillende verbindingen waaronder siRNA, chemotherapeutische middelen, en kleine moleculen.
De muis borstklier bestaat uit een complex ductaal-alveolaire boom die convergeert in een centraal kanaal in de tepel. In muizen en mensen, de meerderheid van borsttumoren oorsprong in de epitheelcellen van de melkkanalen. Huidige beschikbare behandelingen omvatten intraveneuze chemotherapie, bestraling en chirurgie. Gelokaliseerde intraductal behandelingen zijn onderzocht 1-3 en bieden aanzienlijke voordelen in termen van verminderde toxiciteit en de bijwerkingen. Echter, een aantal uitdagingen blijven voordat deze op grotere schaal kan worden toegepast. Het vermogen om vergelijkbare procedures in de muis borstklier vergemakkelijkt de karakterisering van intraductal interventies. Hier presenteren we een niet-invasieve werkwijze voor de levering van reagentia direct in de muizen mammaire kanaal.
Intraductale levering van chemotherapeutische agenten in beide borstkankerpatiënten en muismodellen al eerder is aangetoond dat het zeer effectief met geen bewijs van te zijnsystemische toxiciteit of langdurige histopathologische veranderingen 3-6. Bovendien hebben tumorcel injectie en lentivirale vector levering van oncogenen aangetoond eerder haalbaar zijn via intraductale injectie 7-10.
Naast drug delivery, deze procedure is bruikbaar voor plaatselijke uitschakeling van borstklier genen door intraductal injectie van siRNA. Injectie van kleine hoeveelheden siRNA oplossing is effectief zonder de anatomie en fysiologie van de borstklier. In ons laboratorium hebben we onlangs succesvol gebleken tot zwijgen brengen van de belangrijkste bemiddelaar genen in transgene muizen die spontaan ontwikkelen borsttumoren resulteert in preventie van progressie van de tumor (Brock et al.., Ongepubliceerd). We hebben kunnen tweewekelijkse injecties in dezelfde nippels in 2 weken te herhalen tot 7 keer zonder zichtbare weefselschade of toxiciteit geweest.
Intraductale injecties kunnen worden getimed in een volwassen muis om te ont pakkenopmentally-specifieke gebeurtenissen om ontwikkeling van de borstklier relevant tijdens de zwangerschap, borstvoeding, en involutie of latere stadia van de tumor ontwikkeling en progressie richten. Maagdelijke vrouwtjes zo jong als 8 weken oud zijn niet-invasief geïnjecteerd in ons laboratorium.
Transgene en knockout muizen zijn waardevolle tools om de in vivo rol van individuele genen in borstkanker. Het is echter kostbaar en tijdrovend om deze dieren te genereren en het gen knockdown meestal alomtegenwoordig die soms uitsluit ons herkent de specifieke effecten van dat gen op de borstklier. Daarom zou een gerichte knockdown gevallen van niet-specifieke bijwerkingen en toxiciteit in andere organen verminderen.
De intraductal injectie van siRNA hier gepresenteerde maakt de gelokaliseerde gen knock-down in de muis borstklier. Het is een snelle werkwijze voor gerichte en gelokaliseerde geneesmiddelafgifte aan de borstklier niet beperkt tot siRNA levering. Een dergelijke borstklier-specifieke geneesmiddelafgifte vermijdt onspecifieke bijwerkingen en toxiciteit voor andere organen en maakt de studie van gen veranderingen op specifieke tijdstippen tijdens ontwikkeling van de borstklier en borstkanker tumorvorming. Er is geen bewijs van siRNA deeltjes in niet-geïnjecteerde klieren, de lever of andere organen leveren verder bewijs dat deze methode biedt een geprefereerde manier voor gelokaliseerde gen knock-down in de borstklier. Bovendien kan de intraductal injectie wekelijks of tweewekelijks worden herhaald gedurende enkele maanden om voor langdurige bewaking van therapeutische middelen.
Deze techniek opent de mogelijkheid voor het testen van de intraductal levering van verschillende reagentia om de muis borstklier kanalen. Vooruitgang in gelokaliseerde afgifte in goed gekarakteriseerde muismodellen dient de toepassing van niet-invasieve versnellen gerichte therapeutische strategieën bij mensen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Michael Goldberg bedanken voor het bereiden van gestabiliseerde siRNA-oplossing en Heather Tobin voor haar hulp bij de dieren. Deze studie werd gefinancierd door DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 tot DEI. De postdoctorale opleiding van SK werd gesteund door de Susan G Komen Foundation (KG101329). De auteurs willen graag Kristin Johnson bedanken voor de voorbereiding van het schema.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |