Summary
माउस स्तन ग्रंथि को जलीय अभिकर्मकों की गैर इनवेसिव intraductal डिलीवरी के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. विधि विशेष रूप से स्तन नलिकाओं को लक्षित स्तन ग्रंथियों के निपल्स में स्थानीयकृत इंजेक्शन का फायदा उठाते हैं. इस तकनीक siRNA, एजेंटों और छोटे अणुओं सहित यौगिकों की एक किस्म के लिए अनुकूल है.
Abstract
इस के साथ साथ हम intraductal इंजेक्शन के माध्यम से माउस स्तन ग्रंथि को विभिन्न अभिकर्मकों वितरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. स्थानीयकृत दवा वितरण और तोड़े नीचे स्तन उपकला भीतर जीन की वजह से इस तरह गर्भावस्था और स्तनपान के रूप में विकास के चरणों से सम्बंधित उपयुक्त लक्षित कर अणुओं की कमी को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है. इस के साथ साथ, हम चूहों की निपल्स में intraductal इंजेक्शन के माध्यम से वयस्कता में किसी भी स्तर पर स्तन ग्रंथि के लिए अभिकर्मकों के स्थानीय वितरण के लिए एक तकनीक का वर्णन. इंजेक्शन संज्ञाहरण के तहत, लाइव चूहों पर किया, और स्तन ग्रंथि के लिए एक गैर इनवेसिव और स्थानीय दवा वितरण के लिए अनुमति देने के किया जा सकता है. इसके अलावा, इंजेक्शन निप्पल को नुकसान पहुँचाए बिना कई महीनों में दोहराया जा सकता है. ऐसे इवांस ब्लू के रूप में महत्वपूर्ण रंगों तकनीक सीखने के लिए बहुत उपयोगी हैं. नीले रंग की intraductal इंजेक्शन पर, पूरे वाहिनीपरक पेड़ आंखों को दिखाई हो जाता है. इसके अलावा, fluorescently लेबल अभिकर्मकों भी के लिए अनुमतिस्तन ग्रंथि के भीतर दृश्य और वितरण. इस तकनीक siRNA, एजेंटों, और छोटे अणुओं सहित यौगिकों की एक किस्म के लिए अनुकूल है.
Introduction
माउस स्तन ग्रंथि निप्पल पर एक केंद्रीय वाहिनी में converges कि एक जटिल वाहिनीपरक-वायुकोशीय पेड़ से बना है. चूहों के साथ ही मनुष्यों में स्तन ट्यूमर के बहुमत दुग्ध नलिकाओं अस्तर उपकला कोशिकाओं में आरंभ. वर्तमान में उपलब्ध उपचार नसों में रसायन चिकित्सा, विकिरण, और सर्जरी शामिल हैं. स्थानीयकृत intraductal उपचार 1-3 पता लगाया और कम विषाक्तता और साइड इफेक्ट के मामले में महत्वपूर्ण लाभ प्रदान किया गया है. इन अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है हालांकि, इससे पहले कई चुनौतियां भी हैं. माउस स्तन ग्रंथि में तुलनीय प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने की क्षमता intraductal हस्तक्षेप के लक्षण वर्णन की सुविधा. यहाँ हम सीधे माउस स्तन वाहिनी में अभिकर्मकों के वितरण के लिए एक गैर इनवेसिव विधि प्रस्तुत करते हैं.
स्तन कैंसर के रोगियों और माउस मॉडल में दोनों एजेंटों के intraductal वितरण पहले के कोई सबूत के साथ अत्यधिक प्रभावी होना दिखाया गया हैप्रणालीगत विषाक्तता या लंबी अवधि के histopathological 3-6 बदल जाता है. इसके अलावा, ट्यूमर सेल इंजेक्शन और ओंकोजीन की lentiviral वेक्टर वितरण पहले से intraductal इंजेक्शन 7-10 के माध्यम से संभव होना दिखाया गया है.
दवा वितरण के अलावा, इस प्रक्रिया siRNA के intraductal इंजेक्शन के माध्यम से स्तन ग्रंथि जीन की स्थानीय मुंह बंद करने के लिए उपयोगी है. SiRNA समाधान की छोटी मात्रा में इंजेक्शन स्तन ग्रंथि की शारीरिक रचना और फिजियोलॉजी फेरबदल के बिना प्रभावी है. हमारी प्रयोगशाला में हम हाल ही में अनायास (बिज्जू एट अल., अप्रकाशित) ट्यूमर प्रगति की रोकथाम में जिसके परिणामस्वरूप स्तन ट्यूमर विकसित कि ट्रांसजेनिक चूहों में प्रमुख मध्यस्थ जीन का सफल मुंह बंद करने से पता चला है. हम नहीं दिखाई ऊतकों को नुकसान या विषाक्तता के साथ 2 सप्ताह के अंतराल में 7 गुना तक एक ही निपल्स में सप्ताह में दो बार इंजेक्शन दोहराने में सक्षम है.
Intraductal इंजेक्शन गतिविधियों को संबोधित करने के लिए एक वयस्क माउस में समय समाप्त किया जा सकता हैगर्भावस्था, स्तनपान, और पेचीदगी के दौरान या ट्यूमर के विकास और प्रगति के दौरान बाद के चरणों को लक्षित करने के लिए स्तन ग्रंथि विकास के लिए प्रासंगिक opmentally विशेष घटनाओं. उम्र के 8 सप्ताह के रूप में युवा के रूप में कुंवारी महिलाओं हमारी प्रयोगशाला में गैर invasively इंजेक्शन दिया गया है.
Protocol
1. इंजेक्शन समाधान की तैयारी
- फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) या हित के अन्य जलीय घोल में 0.2% इवांस नीले रंग की डाई तैयार करें. यह महत्वपूर्ण डाई intraductal इंजेक्शन की सफलता का आकलन करने के लिए उपयोगी है और तकनीक में विशेषज्ञता विकसित जब एक दृश्य सहायता के रूप में सिफारिश की है.
आवश्यक मात्रा इंजेक्शन जा ग्रंथियों की संख्या और स्थान पर निर्भर करेगा. मादा चूहों के सभी 10 स्तन ग्रंथियों इंजेक्शन जा सकता है, लेकिन कारण छोटे ग्रंथि के आकार को, ग्रंथि जोड़े 1 और 5 आम तौर पर समाधान के 10 μl इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं. अन्य सभी स्तन जोड़े 20 μl इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं. इन संस्करणों पूरे वाहिनीपरक पेड़ को भरने के लिए पर्याप्त हैं.
2. शल्यक्रिया पूर्व तैयारी
- प्रत्येक माउस के शरीर के वजन रिकार्ड. सभी preclinical अध्ययन के साथ के रूप में, पशु भार संभावित विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए (सप्ताह में दो बार या अधिक) नियमित रूप से निगरानी की जानी चाहिए.
- एम चतनाशून्यएक isoflurane कक्ष का उपयोग ouse और आंख चिकनाई लागू होते हैं. प्रक्रिया के दौरान चूहों एक नाक शंकु के माध्यम से ऑक्सीजन में isoflurane की साँस 2-4% एकाग्रता का उपयोग anesthetized किया जाता रहेगा. ध्यान तदनुसार isoflurane के स्तर का समायोजन, श्वसन दर में परिवर्तन के लिए माउस की निगरानी.
- Subcutaneously पूर्व analgesia के रूप में प्रक्रिया को meloxicam (5-10 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन.
- निपल क्षेत्र के लिए एक काउंटर पर बालों को हटाने क्रीम लगाओ. 5 मिनट रुको और धीरे से एक परिपत्र गति का उपयोग करते हुए एक कपास टिप applicator के साथ खुले बाल हटा दें. गर्म पानी से गीला नम कागज तौलिए का उपयोग क्रीम निकालें. शेविंग के कारण निपल्स हानिकारक के जोखिम के लिए अनुशंसित नहीं है.
- धीरे हाथ - पांव नीचे टेप से त्रिविमेक्ष तहत माउस सुरक्षित.
- शराब swabs के साथ स्वच्छ इंजेक्शन साइटों.
3. Intraductal इंजेक्शन
- त्रिविमेक्ष तहत इंजेक्शन के लिए उपयुक्त निपल्स जानें. Twee सूक्ष्म विदारक ठीक प्रयोग करेंनिपल खोलने को शामिल किया गया है कि किसी भी मृत त्वचा को हटाने के लिए zers.
- चिपका एक 33 जी धातु हब सुई के साथ एक 50 μl सिरिंज में लोड इंजेक्शन समाधान के 10-20 μl. कभी कभी, इंजेक्शन के बाद, थोड़ी मात्रा (1 μl या कम) सुई को बाहर खींच पर निपल से बाहर लीक कर सकते हैं. इसलिए, यह संभावित नुकसान के लिए खाते में क्रमशः 11 या 21 μl इंजेक्षन करने के लिए सिफारिश की है.
- ठीक चिमटी के साथ धीरे निप्पल पकड़ और इंजेक्शन के लिए यह स्थिति थोड़ा उठा. यह निप्पल में कटौती करने के लिए आवश्यक नहीं है.
- तेजी से वाहिनीपरक lumens भीतर तरल पदार्थ ले जाकर वजह से संभावित नुकसान को कम करने के लिए धीरे धीरे समाधान इंजेक्षन. इंजेक्शन की दर लगभग 40 μl / मिनट पर बनाए रखा जाना चाहिए.
4. पश्चात की देखभाल
- इंजेक्शन स्थल का निरीक्षण करें. निपल क्षेत्र या आसपास के ऊतकों को आघात के कोई संकेत नहीं होना चाहिए. निपल आसपास के क्षेत्र में सूजन होने की संभावना एक स्तन वसा पैड इंजेक्शन अधिक तत्पर इंगित करता हैएक सफल intraductal इंजेक्शन से आर.
- नाक शंकु से पशु निकालें और वसूली के लिए एक अलग पिंजरे में ले जाएँ. हाइपोथर्मिया को रोकने और वसूली में सहायता करने के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे पिंजरे रखें. चूहे अकेले रखे जाते हैं और वे चेतना और गतिशीलता हासिल जब तक बारीकी से नजर रखी जाएगी.
5. स्तन ग्रंथि ऊतक के विश्लेषण
- अध्ययन के पूरा होने पर, चूहों एक अलग कक्ष में सीओ 2 संकुचित गैस निम्नलिखित ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized हैं. स्तन ग्रंथियों excised हैं और पूरे माउंट तैयारी 11, ऊतक विज्ञान, या शाही सेना और प्रोटीन अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Representative Results
निपल्स आसानी बाल यह (चित्रा 1 ए) के आसपास के क्षेत्र में हटा दिया गया है एक बार एक stereomicroscope का उपयोग स्थानीयकृत किया जा सकता है. इंजेक्शन तकनीक में महारत हासिल करने के लिए, यह इवांस नीले डाई इंजेक्षन और ग्रंथि की अखंडता (आंकड़े 1 बी और सी) पर नजर रखने की सिफारिश की है. यह दृष्टिकोण भी एक नेत्रहीन डाई पूरे वाहिनीपरक प्रणाली (आंकड़े 1 सी और 2 ए) तक पहुँच जाता है कि क्या आकलन कर सकते हैं के रूप में प्रत्येक ग्रंथि में इंजेक्ट किया जा उपयुक्त संस्करणों के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. इंजेक्शन इवांस नीले छवि के एक छवि तो पूरे वाहिनीपरक पेड़ कारमाइन फिटकिरी डाई (चित्रा 2 बी) के साथ दाग है जिसमें पूरे घुड़सवार स्तन ग्रंथि, की तुलना में किया जा सकता है.
इस इंजेक्शन पद्धति की मजबूती ऑपरेटर पर निर्भर है कि कृपया ध्यान दें. उदाहरण के लिए, वाहिनी perforating एक स्तन वसा पैड इंजेक्शन का परिणाम देगा और समाधान इंजेक्शन भी तेजी ductal उपकला सेल को नुकसान पहुंचा सकता हैलोकसभा और एक भड़काऊ प्रतिक्रिया भड़काने. सफल intraductal इंजेक्शन स्तन ग्रंथि के लिए स्थानीय दवा वितरण सक्षम बनाता है और अक्सर अन्यथा मनाया गैर विशिष्ट पक्ष प्रभाव कम कर देता है.
Fluorescently इंजेक्शन के साथ एक ग्रंथि का एक उदाहरण छवि 3 चित्र में दिखाया गया है cyclophilin (एक गैर जरूरी जीन) को लक्षित siRNA टैग किया.
चित्रा 1. एक वंक्षण स्तन ग्रंथि इवांस नीले रंग के साथ निपल के माध्यम से इंजेक्शन. 20 μl इवांस नीले रंग के साथ इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन और बी से पहले निप्पल के ए) भूमिका). कोई सूजन या ऊतकों को नुकसान त्वचा खोलने पर. सी) मनाया जाता है, डाई पूरे स्तन वाहिनीपरक पेड़ के दृश्य परमिट.
चित्रा 2. इवांस नीले में के विश्लेषण के पूरे माउंटjected ग्रंथि. ए) पशु से excised और तुरंत वसा के बाद लाल रंग रंग के साथ एक ही ग्रंथि का इंजेक्शन. बी) पूरे माउंट धुंधला के बाद एक गिलास स्लाइड पर फैल एक विच्छेदित ग्रंथि के प्रतिनिधि छवि को मंजूरी दे दी गई थी. ए) के साथ तुलना इंजेक्शन समाधान स्तन वाहिनीपरक पेड़ भरता है और ग्रंथि anatomically बरकरार है कि पुष्टि करता है.
चित्रा 3. ताजा ऊतक के नमूने के फ्लोरोसेंट siRNA के intraductal वितरण. प्रतिनिधि छवि, 48 घंटा postinjection excised.
Discussion
ट्रांसजेनिक और पीटा चूहों में स्तन कैंसर में व्यक्तिगत जीनों के vivo भूमिका के अध्ययन के लिए अमूल्य उपकरण हैं. हालांकि, यह महंगा है और समय लेने वाली इन जानवरों उत्पन्न करने के लिए है और जीन पछाड़ना कभी कभी स्तन ग्रंथि पर कि जीन के विशिष्ट प्रभाव को पहचानने से हमें अलग करता है, जो आम तौर पर हर जगह है. इसलिए, एक लक्षित पछाड़ना अन्य अंगों में गैर विशिष्ट पक्ष प्रभाव और विषाक्तता के मुद्दों को कम करेगा.
यहाँ प्रस्तुत siRNA के intraductal इंजेक्शन माउस स्तन ग्रंथि में स्थानीयकृत जीन पछाड़ना सक्षम बनाता है. यह siRNA वितरण तक ही सीमित नहीं स्तन ग्रंथि के लिए एक लक्षित और स्थानीय दवा वितरण के लिए एक तेजी से विधि है. इस तरह की एक स्तन ग्रंथि विशेष दवा वितरण अन्य अंगों को unspecific ओर का प्रभाव और विषाक्तता से बचा जाता है और स्तन ग्रंथि विकास और स्तन ट्यूमर गठन के दौरान विशिष्ट समय बिंदुओं पर जीन परिवर्तन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. सी के कोई सबूत नहीं हैगैर इंजेक्शन ग्रंथियों में आरएनए कण, जिगर या इस विधि स्तन ग्रंथि में स्थानीयकृत जीन पछाड़ना के लिए एक पसंदीदा तरीका प्रस्तुत करता है कि आगे सबूत उपलब्ध कराने के अन्य अंगों. इसके अलावा, intraductal इंजेक्शन चिकित्सीय एजेंट के लंबे समय तक निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए कई महीनों में साप्ताहिक या सप्ताह में दो बार दोहराया जा सकता है.
इस तकनीक माउस स्तन नलिकाओं को विभिन्न अभिकर्मकों के intraductal वितरण परख करने की क्रिया के लिए संभावना को खोलता है. अच्छी तरह से विशेषता माउस मॉडल में स्थानीय वितरण के क्षेत्र में अग्रिम गैर इनवेसिव आवेदन में तेजी लाने चाहिए, मानव में चिकित्सीय रणनीतियों को निशाना बनाया.
Disclosures
लेखक कोई वित्तीय खुलासे है.
Acknowledgments
लेखकों जानवरों के साथ उसकी सहायता के लिए स्थिर siRNA समाधान और हीथ टोबिन की तैयारी के लिए माइकल गोल्डबर्ग को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन DEI को डीओडी अन्वेषक पुरस्कार W81XWH-08-1-0659 द्वारा वित्त पोषित किया गया. एस के postdoctoral प्रशिक्षण सुसान जी Komen फाउंडेशन (KG101329) द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों योजनाबद्ध की तैयारी के लिए क्रिस्टिन जॉनसन को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
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