Summary
マウス乳腺水性試薬の非侵襲管内送達のためのプロトコルが記載されている。この方法は、特に乳管を対象とした乳腺の乳首にローカライズ注入を利用しています。この技術は、siRNA、化学療法剤および小分子を含む化合物の様々な適合可能である。
Abstract
ここに私たちは、管内注射を経由して、マウスの乳腺への様々な試薬を提供するためのプロトコルを記述します。局所的な薬物送達およびノックダウン乳腺上皮内の遺伝子のは、そのような妊娠や授乳などの発達段階とは無関係である、適切な標的化分子の不足のために達成することは困難であった。ここで、我々はマウスの乳首に管内注射によって成人期にどの段階で乳腺に試薬の局所送達するための技術について説明します。注射は、麻酔下で、生きたマウスで行い、乳腺に対して非侵襲的で局所的な薬物送達を可能にすることができる。さらに、注射は、ニップルを損傷することなく、数ヶ月にわたって繰り返すことができる。このようなエバンスブルーなどの重要な染料は、テクニックを学ぶことは非常に有用である。青色色素の管内注入すると、全体の乳管ツリーは、目に見えるようになる。さらに、蛍光標識された試薬も可能にする乳腺内の可視化と配布。この技術は、siRNA、化学療法剤、および小分子を含む種々の化合物に適応可能である。
Introduction
マウス乳腺腺は乳首の中央ダクトに収束する複雑な乳管肺胞ツリーで構成されている。マウスだけでなくヒトでは、乳房の腫瘍の大部分は、乳管の内側を覆う上皮細胞に由来する。現在利用可能な治療は、静脈内化学療法、放射線、手術が含まれる。ローカライズされた管内の治療は、1〜3を探検し、減少した毒性や副作用の点で重要な利点を提供しています。これらは、より広く適用することができる前に、しかし、いくつかの課題が残っている。マウス乳腺腺で同等の手順を実行する能力は、管内介入の特徴付けを容易にする。ここでは、直接マウス乳腺ダクト内に試薬を送達するための非侵襲的方法を提示する。
乳癌患者およびマウスモデルの両方における化学療法剤の管内送達は、以前の証拠を有する高度に有効であることが示された全身毒性や長期の組織病 理学的には3-6に変更されます。さらに、腫瘍細胞注射と癌遺伝子のレンチウイルスベクター送達は、管内噴射7-10を介して実現可能であることが以前に示されている。
薬物送達に加えて、この手順は、siRNAの管内注入による乳腺遺伝子のサイレンシングローカルに有用である。 siRNA溶液の小容量の注入は乳腺の解剖学と生理学を変更することなく、効果的である。当研究室では最近、自然発生的に（Brockさんら 、未発表）腫瘍進行の予防になり乳腺腫瘍を発症するトランスジェニックマウスでの重要なメディエーター遺伝子の正常な抑制を示している。私たちは、目に見える組織損傷または毒性を2週間間隔で7回まで同じ乳首に隔週注射を繰り返すことができました。
管内注射は開発に取り組むための成体マウスでタイムアウトすることができます妊娠、授乳、そして退行中または腫瘍の発生および進行の間に、後の段階をターゲットに乳腺発達に関連するopmentally固有のイベント。 8週齢の幼い処女雌は、私たちの研究室で非侵襲的に注入されている。
Protocol
1。注射液の調製
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、または関心のある他の水溶液に0.2％エバンスブルー色素を準備します。この重要な染料は、管内注射の成功を評価するために有用であり、技術の専門知識を開発する際に視覚化助剤として推奨されます。
必要なボリュームを注入する腺の数および位置に依存するであろう。雌マウスは全て10乳腺を注入することができるが、小型化による腺の大きさに、グランドペア1および5は通常、溶液10μlを注射する。他のすべての乳腺のペアは20μLを注入している。これらのボリュームは、全体の乳管樹を満たすのに十分である。
2。術前の準備
- 各マウスの体重を記録します。すべての前臨床試験と同様に、動物の体重は、潜在的な毒性を評価するために（週二回以上）を定期的に監視する必要があります。
- 男を麻酔ウーズイソフルランチャンバーを用いて、目の潤滑剤を塗布。手順の間にマウスはノーズコーンを経由して酸素イソフルランの吸入2〜4％濃度を用いて麻酔され続けます。丁寧に応じてイソフルランのレベルを調整する、呼吸数の変化のためのマウスを監視します。
- 皮下前鎮痛などの手続きにメロキシカム（5月10日MG / kg）を注入する。
- 乳首エリアに店頭脱毛クリームを適用します。 5分待ってから、ゆっくりと円を描くように綿先端アプリケーターで抜け毛を取り除く。ぬるま湯で湿らせ、湿ったペーパータオルを使用してクリームを取り除きます。シェービングが原因乳首を損傷するリスクにはお勧めしません。
- そっと手足を下にテープでステレオスコープの下にマウスを固定します。
- アルコール綿棒で掃除注射部位。
3。管内注射
- ステレオスコープの下に注入されるべき適切な乳首の位置を確認します。細かいマイクロ解剖気取っを使用乳首の開口部を覆う任意の古い角質を除去するzers。
- 貼付33gの金属ハブ針で50μLシリンジにロードされた注射液の10〜20μL。時々、注射の後、少量（1μL以下）針を引き抜く際に乳首から漏出することができます。したがって、潜在的な損失を考慮して、それぞれ11または21μLを注入することをお勧めします。
- 細かいピンセットでそっと乳首を持って、注射のためにそれを配置するために、わずかに持ち上げます。それは乳首を切断する必要はありません。
- 急速乳管ルーメン内の流体を移動させることによって生じる潜在的な損傷を最小限に抑えるために徐々に溶液を注入する。注入速度は、約40μlの/分に維持されるべきである。
4。術後処置
- 注射部位を観察します。乳首領域または周囲の組織への外傷の兆候があってはならない。乳首の周辺の腫れは、おそらく乳房脂肪パッド注入早咲きのを示している成功管内注射よりR。
- ノーズコーンから動物を削除して、再利用するための分別のケージに移動します。低体温症を予防し、回復を支援するために加熱ランプ下のケージを置きます。マウスを単独で収容され、それらが意識と運動性を取り戻すまで、厳密に監視されます。
5。乳腺組織の分析
- 研究の完了時に、マウスを、隔離室で圧縮されたCO 2ガスを以下の頸椎脱臼により安楽死させる。乳腺切除され、ホールマウント調製物11、組織学、またはRNAおよびタンパク質の単離のために使用することができる。
Representative Results
乳首を簡単に髪が（ 図1A）、周辺エリアでは削除された後、実体顕微鏡を使用してローカライズできます。注入技術を習得するためには、エバンスブルー色素を注入し、腺（ 図1BおよびC）の完全性を監視することをお勧めします。このアプローチは、一方が視覚的に色素が全体管系（ 図1Cおよび図2A）に達したか否かを評価することができるように、各腺に注入されるべき適切な量の決定を可能にする。注入されたエバンスブルー画像の画像は、全体乳管ツリーがカーミンミョウバン色素（ 図2B）で染色された全装着乳腺、比較することができる。
この注入法の堅牢性がオペレータに大きく依存していることに注意してください。例えば、ダクトを穿孔すると、乳腺脂肪注入になりますし、溶液を注入することは速すぎて管上皮CELが損傷する恐れがありLSおよび炎症反応を引き起こす。成功した管内注入は乳腺に局所的な薬物送達を可能にし、多くの場合そうでなければ観察される非特異的な副作用を減少させる。
蛍光を注射した腺の画像例を図3に示すシクロフィリン（非必須遺伝子）を標的とするsiRNAタグ。
図1。エバンスブルー色素と、ニップルを介して注入鼠径乳腺。 20μlのエバンスブルー色素注射後の注射とBの前に乳首のA）外観）。腫脹または組織の損傷は、皮膚を開くとします。C）観察されない、染料が全体の乳管ツリーの可視化を可能にする。
図2。エバンスブルーインの分析をホールマウントjected腺。 A）動物から切除し、すぐに脂肪後カルミン色素と同じ腺の注入。B）のホールマウント染色した後、スライドガラス上に広げ解剖し腺の代表画像がクリアされていた。 A）との比較では、注入されたソリューションは、乳管ツリーを満たし、腺は解剖学的に無傷であることを確認する。
図3。蛍光siRNAの管内配信。新鮮な組織サンプルの代表的なイメージは、48時間注入後に切除した。
Discussion
トランスジェニックおよびノックアウトマウスは、乳癌における個々の遺伝子のインビボでの役割を研究するための非常に貴重なツールである。しかしながら、これらの動物を生成するために、コストと時間がかかり、遺伝子ノックダウンは、時には乳腺上のその遺伝子の特異的な効果を認識するから私たちを排除する通常ユビキタスである。したがって、標的ノックダウンは、他の器官における非特異的な副作用および毒性の問題を軽減するであろう。
ここに提示されたsiRNAの管内注入は、マウスの乳腺の局所的な遺伝子ノックダウンを可能にします。これは、siRNA送達に限定されるものではなく、乳腺を標的とし、局所的な薬物送達のための迅速な方法である。このような乳腺特異的薬物送達は、他の器官への非特異的な副作用および毒性を回避し、乳腺発達および乳房腫瘍形成の間の特定の時点での遺伝子変化の研究を可能にする。済州の証拠はない非注射腺中のRNAの粒子、肝臓やこのメソッドは乳腺の局所的な遺伝子ノックダウンのための好ましい方法を提示していることのさらなる証拠を提供する他の臓器。さらに、管内注射は、治療剤の長期モニタリングを可能にするために数ヶ月にわたって毎週または隔週に繰り返すことができる。
この技術は、マウス乳腺管に様々な試薬の管内送達をアッセイするための可能性を開く。よく特徴付けられたマウスモデルにおける局所的送達における進歩は、非侵襲性の適用を加速する必要があり、ヒトにおける治療戦略の標的化。
Disclosures
著者は、財政的な開示がない。
Acknowledgments
著者は、動物との彼女の援助のために安定化siRNA溶液とヘザートービンを製造するための、マイケル·ゴールドバーグに感謝したいと思います。この研究は、DEIのDODイノベーター賞W81XWH-08-1から0659によって資金を供給された。 SKのポスドクトレーニングはスーザンGコーメン財団（KG101329）によってサポートされていました。著者は、回路図の作成のためのクリスティン·ジョンソンに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
References
- Dooley, W. C., et al. Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer. J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).
- Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. Intraductal therapy for the prevention of breast cancer. Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in mammary gland biology and breast cancer research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/ Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Reddy, J. P., Li, Y. The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. , e2828 (2011).
