Ett protokoll för icke-invasiv intraductal leverans av vattenbaserade reagenser till musen bröstkörteln beskrivs. Metoden drar nytta av lokal injektion i bröstvårtorna av bröstkörtlarna riktade bröst kanaler specifikt. Denna teknik är anpassningsbar till en mångfald föreningar inkluderande siRNA, kemoterapeutiska medel och små molekyler.
Häri beskriver vi ett protokoll för att leverera olika reagenser till musen bröstkörteln via intraductal injektioner. Lokaliserad drug delivery och knock-down av gener inom bröst epitel har varit svårt att uppnå på grund av brist på lämpliga målsökande molekyler som är oberoende av utvecklingsstadier som graviditet och amning. Häri beskriver vi en teknik för lokal leverans av reagens till bröstkörteln i något skede i vuxenlivet via intraductal injektion i bröstvårtorna av möss. Injektionerna kan utföras på levande möss, under anestesi, och möjliggöra en icke-invasiv och lokal läkemedelstillförsel till bröstkörteln. Dessutom kan injektioner upprepas under flera månader utan att skada nippeln. Vital färgämnen såsom Evans Blue är till stor hjälp för att lära sig tekniken. Upon intraductal injektion av det blåa färgämnet blir hela duktal träd synlig för ögat. Dessutom är fluorescent märkta reagens medger ocksåvisualisering och distribution inom bröstkörteln. Denna teknik är anpassningsbar till en mångfald föreningar inkluderande siRNA, kemoterapeutiska medel och små molekyler.
Musen bröstkörteln är sammansatt av en komplex duktal-alveolära träd som konvergerar in i en central kanal vid nippeln. Hos möss och människor, de flesta brösttumörer har sitt ursprung i de epitelceller som kantar mjölkgångarna. Nuvarande tillgängliga behandlingar inkluderar intravenös cytostatika, strålning och kirurgi. Lokaliserad intraductal behandlingar har undersökts 1-3 och erbjuder betydande fördelar i form av minskade effekter toxicitet och biverkningar. Men flera utmaningar kvarstår innan dessa kan tillämpas i större utsträckning. Förmågan att utföra liknande förfaranden i musen bröstkörteln underlättar karakteriseringen av intraductal interventioner. Här presenterar vi en icke-invasiv metod för tillförsel av reagens direkt i mus mammary kanalen.
Intraductal leverans av cytostatika i båda bröstcancerpatienter och musmodeller har tidigare visat sig vara mycket effektivt utan tecken påsystemisk toxicitet eller långvarig histopatologiska förändringar 3-6. Vidare har tumörcellinjektion och lentivirusvektor leverans av onkogener tidigare visat sig vara genomförbara via intraductal injektion 7-10.
Förutom läkemedelstillförsel, är detta förfarande användbart för lokal tysta av bröstkörtel gener genom intraductal injektion av siRNA. Injektion av små volymer av siRNA-lösning är effektiv utan att förändra anatomi och fysiologi av bröstkörteln. I vårt laboratorium har vi nyligen visat framgångsrikt tysta av viktiga förmedlar gener i transgena möss som spontant utvecklar brösttumörer som resulterar i att förhindra tumörprogression (Brock et al., Opublicerad). Vi har kunnat upprepa varannan vecka injektioner i samma bröstvårtor upp till 7 gånger i 2-veckors intervall med inga synliga skador vävnad eller toxicitet.
Intraductal injektioner kan travade en vuxen mus för att ta itu med utveckopmentally-specifika händelser relevanta för bröstkörtelutveckling under graviditet, amning och involution eller att rikta senare skeden under tumörutveckling och progression. Virgin kvinnor så unga som 8 veckors ålder har injicerats icke-invasivt i vårt laboratorium.
Transgena och knockout-möss är ovärderliga verktyg för att studera den roll in vivo av enskilda gener i bröstcancer. Men det är kostsamt och tidskrävande att generera dessa djur och genen knockdown är oftast allestädes närvarande som ibland hindrar oss från att erkänna de specifika effekterna av denna gen på bröstkörteln. Därför skulle en målinriktad knockdown lindra emissioner av icke-specifika biverkningar och toxicitet i andra organ.
Den intraductal injektion av siRNA presenteras här möjliggör lokaliserade genen knockdown i musen bröstkörteln. Det är en snabb metod för en målinriktad och lokal läkemedelstillförsel till bröstkörteln inte begränsat till siRNA delivery. En sådan bröstkörtelspecifik läkemedelstillförsel undviker ospecifika biverkningar och toxicitet till andra organ och tillåter studier av genförändringar vid specifika tidpunkter under bröstkörtelutveckling och brösttumörbildning. Det finns inga belägg för siRNA partiklar i icke-injicerade körtlar, lever eller andra organ som ger ytterligare belägg för att denna metod ger ett föredraget sätt för lokaliserad gen knockdown i bröstkörteln. Dessutom kan de intraductal injektionerna upprepas varje vecka eller varannan vecka under flera månader för att möjliggöra långtidsövervakning av läkemedel.
Denna teknik öppnar upp möjligheten för att analysera den intraductal leverans av olika reagenser till musen bröstkanalerna. Framsteg inom lokal leverans i väl karakteriserade musmodeller bör påskynda tillämpningen av icke-invasiv, riktade terapeutiska strategier hos människor.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Michael Goldberg för beredning stabiliserad siRNA lösning och Heather Tobin för hennes hjälp med djuren. Denna studie har finansierats av DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 till DEI. Den postdoktorala utbildning av SK stöddes av Susan G Komen stiftelse (KG101329). Författarna vill tacka Kristin Johnson för beredning av den schematiska.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |