Denne artikel præsenterer en protokol for en kontekstuel og cued frygt condition test med en video analyse system til at vurdere frygt indlæring og hukommelse i mus.
Den kontekstuelle og cued frygt condition test er en af de adfærdsmæssige test, der vurderer evne mus til at lære og huske en sammenhæng mellem miljømæssige signaler og afskrækningsmiddel erfaringer. I denne test anbringes musene i en konditioneringskammeret og får afklip af en betinget stimulus (en auditiv cue) og en aversiv ubetinget stimulus (en elektrisk fodchok). Efter en tidsforsinkelse musene udsat for samme konditioneringskammeret og en anderledes formet kammer med præsentation af den auditive stikord. Frysning adfærd under testen måles som et indeks af frygt hukommelse. At analysere adfærden automatisk, har vi udviklet en video analysere systemet ved hjælp af ImageFZ software program, som er tilgængelig som en gratis download på http://www.mouse-phenotype.org/. Her for at vise detaljerne i vores protokol, viser vi vores procedure for kontekstuelle og cued frygt condition test i C57BL/6J-mus bruge ImageFZ system. Derudover har vi valideret vores protokol og videoen analysere systemets ydeevne ved at sammenligne frysning tid målt ved ImageFZ system eller en photobeam-baseret computer målesystem med at scoret af en menneskelig observatør. Som vist i vores repræsentative resultater, som er tilvejebragt af ImageFZ svarede til dem analyseret ved en menneskelig observatør, der angiver, at den adfærdsmæssige analyse under anvendelse af ImageFZ system er meget pålidelige. Den nuværende film artikel giver detaljerede oplysninger om de testprocedurer og vil fremme forståelsen af den eksperimentelle situation.
Den kontekstuelle og cued frygt condition test er den adfærdsmæssige paradigme anvendes til at vurdere associativ frygt indlæring og hukommelse hos gnavere 1-3. Denne test har været meget anvendt til at forstå de neurobiologiske mekanismer frygt indlæring og hukommelse i transgene og knockout-mus 1,4-16. Frysning adfærd, der er defineret som fuldstændig ubevægelighed med undtagelse af vejrtrækning, er en fælles reaktion på frygtsomme situationer. I denne adfærdsmæssige paradigme, efter at dyrene er udsat for en parring af en auditiv cue med en elektrisk fodchok, de reagerer på frygt-producerende stimulus ved at vise frysning adfærd, som måles som et indeks for associativ frygt indlæring og hukommelse. Denne test kræver mindre omfattende udstyr, mindre fysisk anstrengelse af investigator, og meget mindre træningstid for mus end andre indlæring og hukommelse opgaver, det kræver generelt ca 5-10 min / dag per mus i 2 dage. Selv om testproceduren er simple og kræver lidt tid til at udføre, skal investigator omhyggeligt observere og måle mus adfærd, og derfor har flere automatiske målesystemer er udviklet til at gennemføre adfærdsanalyse 17-20. Vores video-analyse-system, som vi har udviklet med ImageFZ software program, der giver os mulighed for nemt at analysere adfærd frysning og producere meget pålidelige resultater. Denne artikel indeholder detaljerede oplysninger om vores testprocedure og beskriver, hvordan du bruger ImageFZ program.
Den kontekstuelle og cued frygt condition test er en af de mest anvendte paradigmer at vurdere indlæring og hukommelse. Denne test er en form for pavlovsk condition i, som en sammenslutning er indgået mellem en kontekst og / eller en betinget stimulus (auditiv cue), og et afskrækningsmiddel stimulus (elektrisk fodchok). Efter blot et enkelt parring af kontekst / auditive cue og fodchok, mus udviser langvarig frost, når de står med enten forbindelse eller stikord. I denne test er frysning adfærd anvendes som et indeks af frygt hukommelse. Farmakologiske og læsion undersøgelser har afsløret, at hukommelsen dannelse, konsolidering og genfinding er reguleret af flere områder af hjernen, såsom amygdala, hippocampus og præfrontale cortex 3,33-35. Desuden har molekylærgenetiske undersøgelser vist betydningen af specifikke gener og molekyler, der er involveret i indlæring og hukommelse i disse områder af hjernen ved hjælp af gensplejsede mus 36. Derfor er denne test er simpee og nyttigt for at udforske den neurobiologiske grundlag underliggende frygt indlæring og hukommelse. I denne film artikel introducerede vi vores protokol for at give eksperimentatorer med detaljerede oplysninger til at forstå og let at udføre testen.
Frysning adfærd blev kvantificeret gennem direkte observation af menneskelige eksperimentatorer. Der forventes en veluddannet forsøgslederen for at producere pålidelige, stabile resultater på tværs af observationer. Men denne metode indebærer potentielle problemer, såsom forskelle i observationsmetoden, observatør bias, og simple kvantificering fejl, hvilket gør det vanskeligt direkte at sammenligne resultaterne fra uafhængige eksperimentatorer og forskellige laboratorier. En automatiseret photobeam-baseret computer målesystem er også blevet anvendt 26,30-32. Men dette system giver også potentielle problemer med at måle indefrysning adfærd. På grund af følerindretningen, kan dette system være i stand til at detektere små bevægelser af hovedet, der ville typically blive scoret som "aktiv" gennem menneskelig observation. Desuden kan rysten under frysning betragtes som nonfreezing fordi når et dyr fryser, intermitterende afbrydelser i photobeam observeres som følge af rysten. Som en alternativ metode, har automatiseret billede-og video-analysesystem udviklet 17-20,37,38. ANAGNOSTARAS et al. 37. beskrev nogle systemer med billedanalyse software programmer, der har god gyldighed og score frysning godt 17,20,37-38. Imidlertid har de fleste af disse systemer og analyse programmer, der skal indhentes fra kommercielle leverandører, og er typisk dyre. Vi udviklede det ImageFZ software program til analyse af frost adfærd, og dette program er distribueret som et gratis program. ImageFZ registrerer musen som et organ af pixels (en partikel) og diskriminerer subtil mus bevægelse som »indefrysning« eller »ikke-frysning«, afhængig af mængden afområde af ikke-overlappende områder mellem partikler af hvert par af på hinanden følgende billeder. Som vist i de repræsentative resultater målinger ved hjælp af ImageFZ program er i overensstemmelse med eller mere præcise end opnået under anvendelse af andre metoder. Således ImageFZ programmet måler automatisk adfærd, menneskelige iagttagere dømme som frysning hjælp definerede kriterier. Desuden ImageFZ programmet beregner distance (cm) før, under og efter fodchok eksponering lette en vurdering af chok følsomhed og analyse af frysning adfærd.
Findes metodologiske forskelle mellem laboratorier. Disse forskelle kan resultere i vanskeligheder med at sammenligne data mellem laboratorier og i at gentage resultater i forskellige laboratorier. For at få mere stabile og sammenlignelige data, er det nødvendigt at standardisere forsøgsprotokollen så meget som muligt. Analysen system ImageFZ fører til automatisering af testprocedurer, som kan bidrage tilstandardisering af protokoller anvendes på tværs af laboratorier.
Flere adfærdsmæssige reaktioner skal overvejes, når man analyserer frysning adfærd. Først, når dyrene står over for en frygtelig situation, kan de flygter i stedet for at fryse 39. Flugt er en af de frygtreaktioner og dens forekomst vil føre til undervurdering frygt hukommelse. For det andet, kan frysning afhænge af en generel aktivitetsniveau, og har brug for aktivitetsniveauet i forsøgs-og kontrol mus, der skal undersøges. For eksempel, selv om mus mangler M1 muskarine acetylcholin receptor viste reducerede niveauer af frysning forhold til vild type mus, forskellige adfærdsmæssige test viste, at resultaterne kan tilskrives deres hyperaktivitet fænotype i stedet for deres hukommelsessvækkelse 18. ImageFZ beregner afstanden (cm) rejste med fagene. Dataene er til rådighed til at undersøge, om forskelle i de generelle aktivitetsniveau mellem fag. Hvis der er en gruppe forskel iden distance, en mulig tilgang til problemet er at overveje den tilbagelagte afstand i løbet af de første 2 min uddannelse som baseline aktivitet og for at bruge en undertrykkelse ratio (undertrykkelse ratio = (aktivitet under afprøvning) / (aktivitet under baseline + aktivitet under afprøvning)) som en sekundær indeks af frygt 17,40. Endelig kan en forskel i smertefølsomhed, inducere ændringer i reaktivitet til en elektrisk fodchok eventuelt resultere i variationer i frysning adfærd. ImageFZ beregner også distance (cm) i detaljer, 2 sekunder før en eksponering af en 2 sek fodchok til 2 sek efter eksponering (6 sekunder), som kan anvendes som et indeks for fodchok følsomhed.
Er blevet udviklet video-analysesystem til måling indefrysning adfærd albino, sort, agouti, og fortyndes brune mus. ImageFZ bruger en sort gulv bakke og sorte gitre til at undersøge hvide mus (se figur 1B). De sorte net er lavet af spe allierede forarbejdede metaller med belagt sort maling og har en elektrisk ledningsevne, der svarer til de noncoated metalgitre, der typisk anvendes til sorte mus. ImageFZ analyserer også indefrysning adfærd hos rotter og andre gnavere gennem tilpasninger af programmet parametre. I den nuværende version af ImageFZ er opførslen af emnet optaget vha. et videokamera fra den øverste væg til at analysere frysning. ImageFZ kunne også anvendes i en opsætning, hvor billederne er indfanget fra den side af kammeret. Desuden ImageFZ styrer højst 4 apparater. Denne funktion gør det muligt for forskeren at samtidig undersøge 4 mus, hvilket sparer tid og reducerer de potentielle påvirkninger fra forskelle i gennemførelsestid for hvert fag og afprøvning orden på adfærd. Således ImageFZ forenkler testproceduren og analyse af frost adfærd, og dette program letter test med mindre arbejde og uden uddannelse for de adfærdsmæssige eksperimenter.
e_content "> I Miyakawa laboratoriet, har vi vurderet mere end 110 stammer af genetisk modificerede mus og vildtype kontrol mus i kontekstuelle og cued frygt condition test ved hjælp af video-analyse system til at belyse effekten af en given gen på indlæring og hukommelse 41-42 Vi har fået et stort sæt af rå data for mere end 5.000 mus De rå data, der blev brugt til publicerede forskningsartikler 4-16 indgår i 'Mus Fænotype database' som en offentlig database (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Nærværende film artikel giver detaljerede oplysninger om detaljerne i vores eksperimentelle procedure og fremmer forståelsen af de test situation.The authors have nothing to disclose.
Nogle af de data, der vises her blev opnået i laboratoriet af Dr. Jacqueline N. Crawley i det amerikanske National Institute of Mental Health, og vi vil gerne takke hende for at tillade os at vise data i papiret. Vi takker også Kazuo Nakanishi for hans hjælp til at udvikle ImageFZ program for adfærdsanalyse. Denne forskning blev støttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (21.300.121), Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning på innovative områder (Comprehensive Brain Science Network) fra Ministeriet for Undervisning, Videnskab, Sport og Kultur i Japan indrømme fra Neuroinformatik Japan Center (NIJC), og tilskud fra CREST Japan Science and Technology Agency (JST).
ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |