Denne artikkelen presenterer en protokoll for en kontekstuell og spolt frykt condition test ved hjelp av en videoanalysesystem for å vurdere frykt læring og hukommelse i mus.
Den kontekstuelle og spolt frykt condition test er en av de atferdsmessige tester som vurderer muligheten for mus til å lære og huske en sammenheng mellom miljø-signaler og aversive opplevelser. I denne testen blir musene anbragt i en kondisjone kammer og gis parings av en betinget stimulus (en auditiv cue) og en ubehagelig ubetinget stimulus (et elektrisk footshock). Etter en tidsforsinkelse, blir musene utsatt for den samme kondisjonekammer og et annerledes formet kammer med presentasjon av det auditive signalet. Frysing oppførsel i løpet av testen måles som en indeks av frykt minne. Å analysere atferden automatisk, har vi utviklet en video analysere systemet med ImageFZ programvare program, som er tilgjengelig som en gratis nedlasting på http://www.mouse-phenotype.org/. Her, for å vise detaljene i vår protokoll, vi viser vår prosedyre for kontekstuell og spolt frykt condition test i C57BL/6J mus bruker ImageFZ system. I tillegg bekreftet vi vår protokollen og videoanalysesystemytelsen ved å sammenligne fryse tid målt ved ImageFZ system eller et photobeam-basert datamaskin målesystem med det lages av en menneskelig observatør. Som vist i våre representative resultater, de data som oppnås ved ImageFZ var lik de som ble analysert ved hjelp av en menneskelig observatør, noe som indikerer at de atferdsmessige analyse ved hjelp av ImageFZ systemet er meget pålitelig. Den nåværende filmen artikkelen gir detaljert informasjon om testprosedyrene og vil fremme forståelsen av den eksperimentelle situasjonen.
Den kontekstuelle og spolt frykt condition test er den atferds paradigmet brukes til å vurdere assosiative frykt læring og hukommelse hos gnagere 1-3. Denne testen har vært mye brukt for å forstå nevrobiologiske mekanismer av frykt læring og hukommelse i transgene og knockout mus 1,4-16. Frysing oppførsel, som er definert som fullstendig immobilitet med unntak av pusting, er en vanlig reaksjon for å redde situasjoner. I denne atferds paradigmet, etter at dyr blir utsatt for en sammenkobling av en auditiv kø med en elektrisk footshock, de reagerer på frykt-produserende stimulans ved å vise frysing atferd, som er målt som en indeks for assosiativ frykt læring og hukommelse. Denne testen krever mindre forseggjort utstyr, mindre fysisk anstrengelse av utprøver, og mye mindre treningstid for mus enn andre lærings-og hukommelsesoppgaver, det krever vanligvis ca 5-10 min / dag per mus for to dager. Selv om testprosedyren er simple og krever lite tid til å utføre, må etterforsker nøye observere og måle muse atferd, og derfor har flere automatiserte målesystemer er utviklet for å gjennomføre atferdsanalyse 17-20. Vår video-analyse system, som vi har utviklet med ImageFZ program, tillater oss å enkelt analysere frysing atferd og produsere svært pålitelige resultater. Denne artikkelen gir detaljert informasjon på vår testprosedyre og beskriver hvordan du bruker ImageFZ programmet.
Den kontekstuelle og spolt frykt condition test er en av de mest brukte paradigmer for å vurdere læring og hukommelse. Denne testen er en form for Pavlovian condition som en forening er gjort mellom en kontekst og / eller en betinget stimulus (auditiv cue) og en motvilje stimulus (elektrisk footshock). Etter enda en enkelt sammenkobling av konteksten / auditiv kø og footshock, mus vise langvarig frysing når møtt med enten den kontekst eller stikkordet. I denne testen blir fryse oppførsel brukt som en indeks av frykt minne. Farmakologiske og lesjon studier har avdekket at minnet formasjon, konsolidering, og gjenfinning er regulert av flere områder av hjernen, som amygdala, hippocampus, og prefrontal cortex 3,33-35. I tillegg har molekylære genetiske studier demonstrerte betydningen av spesifikke gener og molekyler som er involvert i læring og hukommelse i disse områder av hjernen ved hjelp av genmodifisert mus 36. Derfor er denne testen simple og nyttig for å utforske den nevrobiologisk grunnlag underliggende frykt læring og hukommelse. I denne filmen artikkelen vi introduserte vår protokoll for å gi forskere med detaljert informasjon for å forstå og lett å utføre testen.
Frysing atferd ble kvantifisert gjennom direkte observasjon av menneskelige forskere. En godt trent eksperimentator er forventet å produsere pålitelige, stabile resultater på tvers av observasjoner. Imidlertid innebærer denne metoden potensielle problemer, for eksempel forskjeller i observasjonsmetode, observatør skjevheter, og enkle kvantifisering feil, noe som gjør det vanskelig å direkte sammenligne resultatene fra uavhengige forskere og ulike laboratorier. En automatisert photobeam-basert datamaskin målesystem har også blitt brukt 26,30-32. Men dette systemet presenterer også potensielle problemer med å måle fryse atferd. På grunn av sensorordningen, kan dette systemet være i stand til å oppdage små hodebevegelser som ville typislly scores som "aktiv" gjennom menneskelig observasjon. I tillegg kan skjelving under frysepunktet anses som nonfreezing fordi når et dyr fryser, intermitterende avbrudd i photobeam er observert som følge av skjelving. Som en alternativ metode, har automatiserte image-og video-analyse systemer er utviklet 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 beskrevet noen systemer med bildeanalyse programmer som har god validitet og scorer iskaldt godt 17,20,37-38. Imidlertid er de fleste av disse systemer og analyseprogram må skaffes fra kommersielle leverandører og er vanligvis kostbare. Vi utviklet ImageFZ program for analyse av frysing atferd, og dette programmet er distribuert som et gratis program. ImageFZ oppdager musen som en kropp av piksler (en partikkel) og diskriminerer subtile musebevegelsen som "fryser" eller "non-fryser" avhengig av hvor myeområde av ikke-overlappende regioner mellom partikler av hvert par av etterfølgende bilder. Som vist i de representative resultater, målinger ved hjelp av ImageFZ programmet er i samsvar med, eller mer nøyaktig enn oppnådd ved hjelp av andre metoder. Dermed måler ImageFZ programmet automatisk atferd som menneskelige observatører dømme som frysing ved hjelp av definerte kriterier. I tillegg beregner ImageFZ programmet den tilbakelagte avstanden (cm) før, under og etter eksponering footshock, tilrettelegge for en vurdering av den sjokkfølsomhet og analyse av det fryse oppførsel.
Metodiske forskjeller mellom laboratorier. Disse forskjellene kan resultere i vanskeligheter med å sammenligne data mellom laboratorier og i replikere resultatene i ulike laboratorier. For å oppnå en mer stabil og sammenlignbare data, er det nødvendig å standardtestprotokoll så mye som mulig. Analysesystem med ImageFZ fører til automatisering av testprosedyrer, noe som kan bidra til åstandardisering av protokoller som brukes på tvers av laboratorier.
Flere atferdsmessige reaksjoner må vurderes når analysere frysing atferd. Først når dyrene står overfor en fryktelig situasjon, kan de flykte i stedet for å fryse 39. Flykt er en av frykt svar, og forekomsten vil føre til underslår frykt minne. For det andre kan fryse avhenge av en generell aktivitet, og aktiviteten i eksperimentelle og kontrollmus må undersøkes. For eksempel, selv om mus mangler M1 muskarine acetylcholin-reseptoren viste reduserte nivåer av frysepunktet, sammenlignet med villtype-mus, forskjellige adferdstester viste at resultatene kan tilbakeføres til sin hyperaktivitet fenotype i stedet for deres svekket hukommelse 18.. ImageFZ beregner avstanden (cm) reiste av fagene. Dataene er tilgjengelige for å undersøke hvorvidt forskjeller i de generelle aktivitetsnivå mellom fag. Hvis det er en gruppe forskjelldistanse, en mulig tilnærming til problemet er å vurdere avstanden reist i løpet av første 2 min av trening som grunnlinje aktivitet og å bruke en undertrykkelse ratio (undertrykkelse ratio = (aktivitet under testing) / (aktivitet under baseline + aktivitet under testing)) som en sekundær indeks av frykt 17,40. Endelig kan en forskjell i smertefølsomhet, indusere endringer i reaktiviteten til en elektrisk footshock eventuelt resultere i variasjoner i fryse oppførsel. ImageFZ beregner også den tilbakelagte avstanden (cm) i detalj fra 2 sekunder før en eksponering av en 2 sek footshock til to sekunder etter eksponeringen (for 6 sek), som kan bli brukt som en indeks på footshock følsomhet.
Video-analyse-systemer er blitt utviklet for å måle fryse oppførselen til albino, svart, agouti, og fortynn brune mus. ImageFZ bruker en svart gulv skuffen og svarte tavler for å undersøke hvit mus (se Figur 1B). De svarte tavler er laget av spes ally behandlet metaller belagt med svart maling, og har en elektrisk ledningsevne lik den av de noncoated metallnett, som vanligvis brukes for svart mus. ImageFZ analyserer også frysing atferd hos rotter og andre gnagere gjennom justeringer av programparameterne. I den nåværende versjonen av ImageFZ, er oppførselen til faget er tatt opp med et videokamera fra toppen veggen for å analysere frysing. ImageFZ kan også brukes i et oppsett hvor bildene tatt fra den side av kammeret. I tillegg styrer ImageFZ maksimalt 4 apparatur. Denne funksjonen gjør det mulig for forskeren å samtidig undersøke fire mus, noe som sparer tid og reduserer de potensielle påvirkninger fra forskjeller i gjennomføringstiden for hvert fag og testing orden på atferd. Dermed forenkler ImageFZ testprosedyren og analyse av frysing atferd, og dette programmet forenkler testing med mindre arbeidskraft og uten noen opplæring for de atferdsmessige eksperimenter.
e_content "> I Miyakawa lab, har vi vurdert mer enn 110 stammer av genmanipulerte mus og villtype kontroll mus i den kontekstuelle og spolt frykt condition test ved hjelp av videoanalysesystem for å belyse virkningene av et gitt gen på læring og hukommelse 41-42 Vi har fått et stort sett med rådata for mer enn 5000 mus Rådataene som ble brukt for publiserte forskningsartikler 4-16 inngår i "Mouse Phenotype Database 'som en offentlig database (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Den nåværende filmen artikkelen gir detaljert informasjon om detaljene i vår eksperimentell prosedyre, og fremmer forståelse av testing situasjon.The authors have nothing to disclose.
Noen av dataene er vist her ble innhentet i laboratoriet av Dr. Jacqueline N. Crawley i det amerikanske National Institute of Mental Health og vi ønsker å takke henne for å tillate oss å vise dataene i papiret. Vi takker også Kazuo Nakanishi for hans hjelp i å utvikle ImageFZ program for atferdsanalyse. Denne forskningen ble støttet av Grant-i-Aid for Scientific Research (B) (21300121), Grant-i-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Comprehensive Brain Science Network) fra departementet for utdanning, vitenskap, idrett og kultur i Japan , gi fra Neuroinformatics Japan Center (NIJC), og tilskudd fra CREST av Japan Science and Technology Agency (JSO).
ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
Conditioning chamber | O'Hara & co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
Cued test chamber | O'Hara & co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
Interface | O'Hara & co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
Scrambled shock generator | O'Hara & co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
Shock grid tester (ammeter) | O'Hara & co., Japan | SG-T | |
USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
Soundproof room | O'Hara & co., Japan | CL-4210 | |
Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |