Рано Метаморфические вставки Технология насекомых полета контроля действий

Introduction

Установка электродов, даже с прикрепленными электронных систем в насекомых для телеметрических приложений записи, был основным способом понять, как функцию нервной системы в процессе естественного полета ^1. Присоединение или имплантации искусственных систем у насекомых поставил множество проблем, связанных с потенциалом нарушить естественный полет насекомого. Поверхностная вложение или хирургическое введение искусственных платформ на взрослого насекомого является ненадежным из-за возможного смещения вставленных устройств, вызванных тела, вызванных инерционными и сил напряжения. Внешне прилагается или хирургически вставляются электроды также склонны быть отвергнут насекомых, как инородное тело. Кроме того, операция имплантации требует удаления чешуек и свай вокруг экзоскелета. Толстый слой кутикулы также должен быть пробит для хирургических иннервации, которые могут вызвать повреждение тканей обеспечение, тем самым препятствуя естественной полета насекомого. Все тHESE факторы могут сделать хирургическая или поверхностным операция имплантации сложной и деликатной задачей. В целях смягчения этих проблем, связанных с внешне крепления контроля и зондирования системы для насекомых, роман методология участием метаморфическую рост будет описано в этой статье.

Развитие метаморфических из holometabolic насекомых начинается с трансформации личинки (или нимфы) в взрослым с промежуточной стадии куколки (рис. 1). Процесс метаморфоза включает обширный перепрограммирование тканях, включая дегенерацию последующим ремоделирования. Это преобразование превращает земную личинку со взрослым насекомым демонстрируя несколько сложным поведением ^2,3.

Выживание насекомых после экстремальных парабиотического операций была продемонстрирована где были проведены операции на ранних стадий метаморфизма ^4,5. В этих операций, то с развитием гистогенеза каустикред хирургические раны в ремонте в более короткие сроки. После этих наблюдений, новая методика была разработана, где была выполнена имплантация электропроводных электродов на ранних стадиях метаморфических роста (рис. 1). Это позволяет биомеханики надежное крепление на насекомых ^6. Высоконадежный интерфейс также обеспечены нервной насекомого и нервно-мышечной систем ^7. Этот метод известен как "Ранний Metamorphosis вставки технологии" (вывод) ^8.

После восстановления всей системы тканей, структуры, вставленные в куколки появляются с взрослого насекомого. Летные мышечные группы составляют до 65% от общего грудной массы тела и, таким образом, является относительно удобной мишенью для процедуры EMIT ^9. Во время основной фланге обыграл, изменения в морфологии полета, питающего dorsolongitudinal (DL) и дорсовентральной (DV) мышцы вызвать крыла articulatГеометрия ионно генерировать подъемную ^10. Поэтому функциональная координация DL и DV мышц был активным тема исследования под полета нейрофизиологии. Tethering насекомых в электронном виде запрограммированных визуальных сред был самым распространенным методом для изучения нейрофизиологии сложных двигательных поведения ^11,12. Цилиндрические арены, состоящие из светоизлучающих диодных панелей были использованы для этих виртуальной реальности условиях, где летающие насекомые привязаны в середине и движение моделируется динамического обновления окружающий панорамный визуальное отображение. В случае небольших насекомых, таких как плодовой мушки Drosophila, модем достигается путем присоединения металлический штифт на дорсальную грудной клетки насекомого и размещение штифт под постоянным магнитом ^13,14. Этот метод позволяет только количественное двигательных реакций через визуальных наблюдений с камерами высокой скорости без каких-либо электрофизиологического анализа. Более того, эта метод был неэффективным приостановить больше и тяжелее тело Manduca Sexta. Чтобы решить эту проблему, мы выиграли от магнитно левитирующих кадрах, где легкий вес рамы с магнитами, прикрепленные к их нижней которые левитировать через электромагнитных сил. В сочетании с имеющимися в продаже нейронных усилителей и светодиодных массивов, это обеспечивает платформу для управления выводом полета двигателя и записать, связанных электрофизиологии Manduca Sexta.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Источником материалов и реагентов, необходимых для следовать протоколу предусмотрено в "Реагенты" Таблица ниже.

1. Подготовка Печатные платы (ПХД) для записи электрода Connection

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы обеспечить практическую экспериментальную процедуру, проволочные электроды припаяны к печатной плате, чтобы вставить эти электроды в разъем FFC (гибкий плоский кабель).

1. Вырежьте 0.5x5 см ^{2 части} медью ламината.
2. Использование тонкий наконечник маркера, сделать три 0.1x5cm ² прямоугольника колодки как травление шаблонов масок.
3. Протравите подвергается ламинат с использованием травителя PCB внутри проветриваемом помещении или вытяжного шкафа. Обложка около 1 см длины ламината вырез с нереакционноспособного ленты. Заполните градуированную мензурку с по меньшей мере 100 мл травителя на печатной плате и ленты меди ламинат вырез на внутренней стороне градуированный стакан с скотча. Половина меди ламинат cutouт должна быть погружена в травителя на печатной плате.
4. Поместите стакан на вращающейся платформе в течение 20 мин.
5. Извлеките вырез от травителя и поместить его в химический стакан, наполненный водой в течение 10 мин.
6. Использование папиросной бумаги, применять изопропиловый спирт и удалить маркировку, чтобы разоблачить, не травления меди колодки.
7. Разрежьте печатную плату на меньшие квадраты длиной около 1 см.
8. Отрежьте два куска покрытием, отжигают, проволоки из нержавеющей стали (0,11 "с покрытием, 0,008" голые), используя острый нож к длине 3 см каждый. Эти куски проволоки из нержавеющей стали являются активные электроды, которые будут вставлены в грудной клетки насекомого.
9. Использование лезвие, удалить 4-5 мм от пластиковым покрытием от каждого конца каждого провода. Использование микроскопа рекомендуется.
10. Отрежьте один 0,7 см кусок изолированного провода нержавеющей стали для создания расширения наконечник для заземляющего электрода. Аккуратно удалите покрытие с лезвием или расплавить его с пылу пайки ИКна как выполняется на этапе 1.9.
11. Для подключения заземления, вырезать один кусок гибкого (гибким или индуктор) провода на длину 4,5 см.
12. Припой 0,7 см кусок нержавеющей стали, полученного на стадии 1,10 к проводу заземления, полученного на стадии 1.11. Подвергается наконечник из нержавеющей стали должно быть в конце заземлением.
13. Лента подготовленный электрод доска твердо пайки рабочей использованием нереакционноспособный ленту. Используйте ленту, чтобы замаскировать все, кроме 1-2 мм из площадок на плате, где электроды будут припаяны. Это масках, без пайки конец колодки будут вставлены в разъем FFC, описанной в шаге 4.1.
14. Выравнивание три электродных проволок, так что один конец каждого может быть припаяны к соответствующим прокладки на электроде плате. Применение поток из нержавеющей стали через электродных площадок для облегчения пайки.
15. Припой каждой из открытых электродов на колодки.
16. Погрузить электроды в ацетоне и изопропиловом спирте в течение 10 минкаждый для очистки припоя остатки. Использование ультразвуковой ванне улучшает эффективность очистки.

2. Хирургическое Вносимые в Manduca Sexta Куколки

ПРИМЕЧАНИЕ: Насекомые будут наиболее активными во время переходов между днем ​​и ночью. Таким образом, искусственный дневной / ночной цикл должен быть установлен в пределах камеры насекомых с помощью автоматических таймеров выходе. Они должны быть установлены для имитации 7 ч темноты и 17 ч света цикл.

1. Изучите Sexta куколки Мандука ежедневно, чтобы определить подходящее время вставки. Куколки готовы для вставки примерно один день после того, как крылья обладают темные пятна.
2. Чтобы обезболить куколки, поместите их в холодильник (4C) около 6 часов.
3. Подготовьте вставки рабочее пространство. Рабочее пространство должно включать изопропиловый спирт, острые щипчики, лопасти, и 30 г шприц. Как вариант, цианоакрилат клей может быть использован для повышения фиксацию электрода.
4. Стерилизовать иглу, пинцет и электроды, опуская их в или протирая изопропилового спирта.
5. Снимите куколки из холодильника и перенести его в рабочую область.
6. Определить местоположение на грудной клетке, соответствующей группы мышц, представляющего интерес. В центре внимания работы в этом примере дорсовентральной мышцы, ответственные за движения крыла хода вверх.
7. Используя острый нож, аккуратно поцарапать 1x1 см ² прямоугольник через exocutical слоя. Используя пинцет, медленно снимите эти куски.
8. (Дополнительно) Используйте вакуум для удаления крыла волосы с открытой области грудной клетки.
9. Медленно введите иглу около 5 мм в среднегруди где крылья придают грудной клетки, чтобы создать две точки вставки, нацеленные на группу мышц.
10. С помощью пинцета, руководство двух записи электроды в двух точек вставки.
11. (Необязательно) Чтобы повысить механическую прочность, убрать волосы вокруг электродови щедро применять цианакрилатного клея вокруг каждой точки вставки на грудную клетку с проволочной аппликатора.
12. Подготовить клетку для возникновения с соответствующими материалами (грубая и текстурированных), покрывающей стены и потолок так, что насекомое может подняться на появление. Могут быть использованы перфорированные картонные коробки или упаковки бумаги.
13. Подготовьте жесткой фиксации палку длиной около 6 см и диаметром 2 мм. Пластиковые мешалки, ватный тампон или металлические провода можно использовать для этого шага.
14. Аккуратно вставьте эту палку через отверстие под выступающей хоботка.
15. Fix обе стороны палкой по клетке поверхности такой, что куколка не может вращаться. Расположите куколку внутри клетки таким образом, что среднегрудь вверх. Обширная движение может привести к повреждению электрода, потеря гемолимфы, или сделать вставки бесполезно.

3. Установка заземляющий электрод в Manduca Sexta

ПРИМЕЧАНИЕ: На первом (см.ENCE) электрод должен быть вставлен в животе или дистальных отделах грудной клетки, чтобы предотвратить взаимные сигнала. Эта вставка может быть сделано либо на поздних стадиях развития куколки или после насекомое выходит. Окно для заземляющего электрода должен быть подготовлен в стадии куколки или для куколок или взрослой стадии введения заземляющий электрод.

1. Для куколки вставки стадии: после пилинга из mesothoracic кутикулы вокруг активного электрода (см. шаг 2.7), поцарапать другой прямоугольник через exocutical слоя (около 0.5х0.5 см ²⁾ на спинной части живота рядом с грудной клетки, используя 30 г шприц игла. Вставьте заземляющий электрод в это окно по методике, описанной в разделе 2.
2. Для взрослого вставки этап заземляющий электрод: как только насекомое появилось, поместите его в холодильник при температуре 4 ° С в течение 6 до 24 часов с иммобилизации.
   Остальные шаги такие же, как для куколок и взрослой стадии вставок.
3. Подготовьте INSER Тион рабочее пространство, включая изопропиловый спирт, острыми пинцетом, в 30 G иглы для подкожных инъекций, цианакрилатного клея, кусок проволоки для нанесения клея, тепловой cauterizer (опционально), а также стоматологической восковой палочкой (опционально).
4. Найдите точку вставки примерно 1-2 см от регистрирующих электродов вдоль заднего брюшка.
5. Медленно введите иглу для прокола живота и обеспечить место введения.
6. С помощью пинцета осторожно вставьте заземляющий электрод в месте введения и оказать давление, пока это не глубоко 3-4 мм. Держите электрод на месте и использовать провод применять клей вокруг места введения.
7. (Необязательно) Чтобы повысить механическую прочность, использовать тепловую cauterizer и собрать небольшой (2-3 мм) шарик воска на конце. Поместите кончик близко к месту ввода и применять тепла, в частности, что воск окружает электрод и держит его крепко на месте.

4. Подготовка Совета адаптер

ontent "> ПРИМЕЧАНИЕ:. плата адаптера необходимо подключить электродный доска к беспроводной headstage записи через ФФК (плоский гибкий кабель) разъем Для этого, доска похожа на электродной борту должен быть подготовлен в соответствии с шагами от 1,1 до 1,7 .

1. Припой разъем FFC на одном конце, подготовленной доске.
2. Припой три 30 AWG (American Wire Gauge) подключить провода к трем колодки на другом конце.
3. Припой три мини разъемы для трех площадок на платы адаптера для чтения осциллографа, как описано в следующей стадии.
4. Припой другой конец этих трех проводов к разъему headstage.
5. Закрепить монтажную плату headstage в верхней части левитации кадра.

5. Предварительной записи с осциллографа (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы оценить надежность электродов и наблюдать отношение сигнала к шуму, привязанные осциллографа качество записи может быть до развертывания WirelСистема записи ESS. Мини разъемы проводов на платы адаптера следует использовать для этого.

1. Подключите осциллограф к внеклеточной нервной усилителя записи. Установите параметры усилителя в высоких частот отсечки частотой 1 Гц, низкочастотный отсечения частотой 20 кГц, и коэффициентом усиления 100.
2. Подключите каждому наружному мини проволочных соединителей на платы адаптера для входных каналов усилителя.
3. Снимите насекомое с имплантированного электрода борту из клетки, когда она находится в активном состоянии (в свое время рассвета). Место кусок папиросной бумаги под насекомого для того, чтобы почивать на до начала замеров.
4. С помощью пинцета, сдвиньте электрода плату в рецептора FFC на платы адаптера. Соблюдайте плоский и низкий базовый уровень напряжения, когда насекомое отдыхает и генерация электромиограмме (ЭМГ) шипы, как насекомое машет крыльями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. раздел 6: Наблюдая насекомых полета с Системой Wireless Звукозаписывающая для предстив результаты осциллографа.
5. Отрегулируйте параметры просмотра осциллографа по мере необходимости. Захват данные на осциллограф и сохранить данные.

6. Наблюдений насекомых полета с системой беспроводной Звукозаписывающая

ПРИМЕЧАНИЕ: электромагнитная левитация платформа может быть построен для беспроводной записи сигналов ЭМГ во привязной Manduca Sexta полета. Левитация платформа состоит из рамы разработан, чтобы сбалансировать механизм модема. Левитация позволяет кадр, и поэтому насекомое, рыскания во время тестирования без ограничении привязывать проводов. Рама может быть быстрым-прототип с использованием плавленого моделирование осаждения (FDM) машины. Магнит должен быть присоединен к нижней части этой кадра, подлежащего подвеске серией магнитов в базовой платформы. Насекомое подключен к разъему ФФС подвешенной к верхней части рамы. Это левитации платформа расположена внутри светодиодной Arena, который был построен УсинG 60 панели, состоящие из множества отдельных светодиодов 5x7. Эта система была основана на установленных методов разработки условий для визуальной стимуляции фруктов летит ^{15, 16, 17.} Арена управляется микроконтроллером позволяя моделирования правое и левое направление вращения, а также контролем скорости вращения.

1. Настройка беспроводного систему записи, подключив headstage к разъему платы адаптера на левитации платформы.
2. Удаление насекомых из клетки когда он находится в активном состоянии предпочтительно в свое время рассвете.
3. С помощью пинцета осторожно вставьте электрода плату в рецептора FFC на левитации кадре такой, что насекомое приостанавливается твердо в установке.
4. Поместите магнитный инструмент вблизи магнитного переключателя на headstage для активации беспроводной передачи данных. Синий свет загорается, оповещая о том, что headstage активен.
5. Выключите свет вкомната для полной темноте. Красная лампочка может быть использован для добавления освещение в комнате. Откройте программное обеспечение сбора данных телеметрии на компьютере и выбрать соответствующий предварительно загруженный файл конфигурации, если это предусмотрено. Начните сбор данных, чтобы начать сигналы обзора.
6. Выберите соответствующий пользовательский интерфейс для наблюдения сигналов ЭМГ на беспроводной системы записи для обеспечения надежного беспроводного операции соединения и электрода.
7. Включите все компоненты светодиод Арена: Регулируемый DC питания и микроконтроллер. Микроконтроллер может настроить оборотов в минуту циклического картины света, а также может управлять направлением света вращения.
8. Медленно сбалансировать левитации платформы в арене. Совместите над центром левитации базе тщательно кадр, иначе кадр будет быстро вытащил на землю может травмировать насекомое.
9. Инициировать системы видеозаписи.
10. Выберите соответствующую вкладку записи программного обеспеченияИнтерфейс. Назначить время записи и сохранения файла назначения. Выберите соответствующие настройки вывода для сохранения данных. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сеанс записи в программном обеспечении. Это позволит сохранить файл данных, который может быть импортирован в численных вычислительных средах.
11. Заметим, как насекомое летит в направлении, которое соответствует движению светодиодов. Измените направление светодиодов и убедитесь, что насекомое меняет направление. Выполните это столько раз, сколько это необходимо.

Representative Results

Схема общей процедуры EMIT представлена ​​на рисунке 1, показывающую основные этапы цикла метаморфических в Hawkmoth и соответствующих шагов вставки электрода. Вставка электрод должны быть выполнены в конце стадии куколки от 4 до 7 дней до вылупления. Это позволяет мышечные волокна разработать вокруг электродов и закрепить имплантат в насекомого.

Типичный результат завершенной конце куколки вставки стадии, где две активные электроды и заземляющие электроды были вставлены показано на рисунке 2.

Типичный результат завершенной вставки взрослой стадии, где две активные электроды и заземляющим электродом были вставлены показано на рисунке 3.

Светодиод арена используется, чтобы вызвать поворот во время полета на Sexta Manduca показано на рисунке 4. Микроконтроллер жкак запрограммировано, чтобы контролировать скорость вращения массива LED вертикального изображения. Угловая скорость светодиодного шаблон был установлен в 7,3 градусов в секунду. Магнитной левитации платформа была помещена в центре LED арене, чтобы позволить насекомое свободно вращаться в ответ на LED массива.

На рисунке 5 показана мышц потенциального сигнала, полученного из дорсовентральной мышц с осциллографа до и после крыла хлопаньем. Сигнал был обработан с 100-кратным усилением и фильтр высоких частот 1 Гц и фильтра нижних частот 20 кГц. В период покоя, ни один мускул потенциалы не наблюдается. Мышечные потенциалы во крыла хлопаньем происходят примерно в 15 Гц-20 Гц.

На рисунке 6 показан мышц отношение сигнал приобретенные с беспроводной аппаратуры до и после крыла хлопаньем. В период покоя, ни один мускул потенциалы не наблюдается. Мышечные потенциалы дурьING крыло хлопанье происходят примерно в 15 Гц-20 Гц.

Рисунок 1. EMIT процедуру. Схематическое изображение процедуры, выполняемой на EMIT Manduca Секста, как описано в протоколе.

Рисунок 2. Куколка вставки. Фотография поздней стадии куколки сразу после записи электроды были вставлены с помощью излучают.

Рисунок 3. Мотылек Появление. Фотография взрослой моли с имплантированным записи электродыосле вылупления.

Рисунок 4. Настройка записи. Магнитной левитации платформы и светодиод арена используется для записи сигналов ЭМГ от Мандука полетные мышцы Sexta. Здесь Мандука Sexta выполняет рыскания маневр в ответ на вращающейся LE узором.

Рисунок 5. Осциллограф ЭМГ. Записи 2.5 сек ЭМГ из дорсовентральной мышцы с помощью усилитель и осциллограф.

Рисунок 6. Беспроводной ЭМГ. 1.9сек ЭМГ запись дорсовентральной мышцы с помощью модуля беспроводной записи headstage и программного обеспечения сбора данных.

Discussion

Есть несколько важных шагов в ходе хирургической вставки из регистрирующих электродов, которые влияют на возможность записи данных на более поздних ступенях протокола. Регистрирующие электроды должны быть вставлены в куколки одного дня после экспонирования крыла пятна на ее спинной стороне. Если вставка выполняется два или более дней после этого времени, ткани насекомого не хватит времени, чтобы развить вокруг и стабилизации вставленные электроды. Это может привести к движению имплантированных электродов и ненадежных записей в взрослой стадии.

Важно, чтобы не вставить записи электроды в куколочных полетные мышцы на глубине более 5 мм. В противном случае, гемолимфы приведет к выходу из точки вставки и привести к развитию более слабых мышц полета. Если гемолимфы либо появится, остановить процедуру и позволит куколка 24 часа в сутки, чтобы восстановить, прежде чем пытаться вставить электроды снова. Сайт вставки должны быть очищены йoroughly всего крыла волосы перед электроды вставляются в куколки. Это предотвращает попадание волос установочные отверстия и препятствуя границе раздела электрод ткани.

Для обеспечения оптимального здоровья крыло во взрослом моли, сайт вставки должны быть повторно очищена от крыла волосы накануне вылупления помощью пинцета. Кроме того, рекомендуется использовать пинцет, чтобы ослабить края окна кутикулы, что рассекали с подкожной иглой, чтобы помочь вылупления, происходящих на следующий день. Если клей или гемолимфы высохнет вблизи краев окна кутикулы, моли не смогут завышать свои крылья после вылупления и этот экземпляр не будет полезным для экспериментов.

Хотя раз вставки приведены в дни, они могут незначительно отличаться, как сроки метаморфического развития является функцией выращивания температур для пойкилотермных животных. Приведенные дни для насекомых, выращенных в РТ. Если стандартный 25 °; Используется C инсектарий инкубатор, развитие будет примерно 10-20% быстрее, а время вставки должны быть соответствующим образом скорректированы.

Ограничением данного исследования будет инерция вращения вводится в установки по быстрым прототип ABS пластика левитации кадра. Масса рамы может составлять до 200 грамм в то время как масса мотылька составляет около 4 граммов. Преимущество использования электромагнитной левитации кадр является потеря фрикционного контакта между рамой и опорной конструкции. Тем не менее, использование сравнительно тяжелое кадре вызывает насекомое расходовать больше энергии, чтобы завершить рыскания маневры в ответ на вращающейся светодиодной узором. Модификация с привязывать кадра, используемого в этом исследовании может быть использование менее плотного материала и / или построения тоньше рамку для уменьшения инерционную нагрузку.

Изменения развития в течение метаморфоза принести новые возможности для нейронных методов инженерных научиться насекомые летать.Это замечательное наблюдение, что включение электрод в течение куколки стадиях приводит в облегченном реакции тканей по отношению к взрослой стадии вставок. Вставки Поэтому, выделяющие на основе обеспечения механическое крепление синтетических систем в или на насекомое, понимая предсказуемый нервно-мышечной интерфейс с минимальным короткий срок воздействия на насекомых опорно-двигательного поведения. В течение последних двух десятилетий, robotists, работающие на очень малых масштабах беспилотных летательных аппаратов были вдохновлены полета насекомых. Помимо позволяя новый электрофизиологические технику, процедура EMIT также позволяет насекомых-машинных интерфейсов (IMI), которые могут обеспечить доступ для нейронных инженеров к электрически возбудимых клеток насекомого, чтобы контролировать свою сенсорную и поведенческие физиологию ^8. Это имеет потенциал, чтобы "biobotically" укротить и контролировать передвижение насекомых. Таким образом, конкретная методика представлена ​​в этой статье, не только полезны для изучения полета насекомых, но и дляприручать насекомых как гибридный сантиметровой шкалы полета BioBots ^18. Применение такой гибридной платформы является преобразование насекомых в мобильных системах охраны окружающей среды зондирования. Эти рабочие животные могут потенциально помочь людям в мониторинге ко-поделился экосистемы путем сбора и хранения информации об окружающей среде.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coated stainless steel wire	A-M Systems	791900	0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed
Flexible electrode wire			Litz or inductor wire can be used.
Surface-mount FFC connector	Hirose Connector	FH28E-20S-0.5SH(05)
Tweezers	Grobet USA		Clean with 70% alcohol before use on the insect.
Kim-Wipes	Kimberly-Clark Worldwide	34155	Any size delicate-wipe tissues can be used.
Teflon tape			5 mm width Teflon tape.
Hypodermic Needle	Becton Dickinson & Co.	30511	20-30 G hypodermic needle can be used. Video showed 30 G.
Rigid fixation stick			Variety of materials can be used (e.g., coffee stirrers)
Insect emergence cage			Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed.
Thermal cauterizer	Advanced Meditech International	CH-HI CT2103 (tip)	Optional equipment used for application of dental wax.
Dental wax	Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma		Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect.
Magnetic levitation platform			Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping.