Tidig Metamorf Inser Teknik för Insect Flight beteendeövervakning
Summary
We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.
Abstract
Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.
Introduction
Infoga elektroder, även med bifogade elektroniska system för insekter för telemetriska inspelning applikationer, har varit en viktig metod för att förstå hur neurala systemen fungerar under naturlig flyg 1. Fästa eller implantera artificiella system i insekter har ställt många utmaningar som innebär potential att störa den naturliga flygningen av insekten. Ytlig kvarstad eller kirurgisk insättning av konstgjorda plattformar på den vuxna insekten är otillförlitlig på grund av eventuell förskjutning av de insatta enheter som orsakas av kropps-inducerad tröghets och stresskrafter. Ytligt fäst eller inopererad elektroder är också benägna att avvisas av insekterna som en främmande kropp. Vidare kräver implantation driften avlägsnandet av skalor och högar runt exoskelett. Det tjocka nagelband lagret måste också penetreras för kirurgiska innervations som kan orsaka säkerheter vävnadsskada och därmed störa den naturliga flygning av insekten. Alla tessa faktorer kan göra en kirurgisk eller ytlig implantation drift en utmanande och grannlaga uppgift. För att mildra dessa farhågor som deltar i externt fästa kontroll-och sensorsystem för insekterna, kommer en ny metod som innebär metamorf tillväxt beskrivs i den här artikeln.
Den metamorphic utveckla holometabolic insekter börjar med omvandlingen av larven (eller nymf) till en vuxen med en intermediär puppstadium (Figur 1). Den metamorfos process innebär en omfattande vävnads omprogrammering inklusive degeneration följt av ombyggnad. Denna omvandling förvandlar en marksänd larv till vuxen insekt visar flera komplexa beteenden 2,3.
Överlevnaden av insekter efter extrema parabiotic operationer har visats där operationer utfördes under de tidiga metamorfa stadier 4,5. I dessa operationer, de utvecklings histogenes caused kirurgiska sår som ska repareras i kortare löptider. Efter dessa observationer, har en ny teknik som utvecklats där implantation av elektriskt ledande elektroder utfördes under tidigare stadier av metamorf tillväxt (Figur 1). Detta möjliggör ett biomekaniskt säker fastsättning på insekten 6. En mycket tillförlitlig gränssnittet är också säkrad med insektens neurala och neuromuskulära system 7. Denna teknik är känd som "tidig metamorfos Insertion Technology" (EMIT) 8.
Efter ombyggnaden av hela vävnadssystem, strukturer insatta i puppan fram med den vuxna insekten. Flygmuskelgrupper fyll upp till 65% av den totala thoraxkroppsmassa, och således är ett relativt bekvämt mål för EMIT procedur 9. Under grundvingslag, förändringar i morfologi flygningen driver dorsolongitudinal (dl) och dorsoventral (dv) muskler orsakar vingen articulation geometri att generera lyft 10. Därför den funktionella samordning av DL och dv muskler har varit en aktiv forskningsområde inom flygneurofysiologi. Tethering insekter i elektroniskt programmerade visuella miljöer har varit den vanligaste metoden för att studera neurofysiologi av komplexa motoriskt beteende 11,12. Cylindriska arenor består av lysdiod paneler har använts för dessa virtuella-reality-miljöer, där flygande insekter är tjudrade i mitten och den rörelse simuleras genom att dynamiskt uppdatera omgivande panorama visuell display. I fallet med små insekter, exempelvis fruktflugan Drosophila, är tjudra uppnås genom att fästa ett metallstift på den dorsala torax av insekten och placera stiftet enligt en permanentmagnet 13,14. Denna metod tillåter endast kvantifiering av motorsvar genom visuella observationer med höghastighetskameror utan elektrofysiologiska analyser. Dessutom detta method har varit ineffektivt att avbryta större och tyngre kropp Manduca sexta. För att lösa detta problem, vi dragit nytta av magnetiskt svävande ramar där låg vikt ramar med magneter kopplade till deras botten är att sväva genom elektromagnetiska krafter. I kombination med kommersiellt tillgängliga neurala förstärkare och LED-arrayer, ger detta en plattform för att styra flyg-motoreffekt och registrera relaterade elektrofysiologi i Manduca sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga steg under kirurgisk insättning av registreringselektroderna som påverkar möjligheten att spela in data i de senare stegen i protokollet. De registreringselektroderna bör infogas i puppan en dag efter uppvisar vingfläckar på ryggsidan. Om insättnings utförs två eller flera dagar efter denna tid kommer insektens vävnaden inte har tillräckligt med tid att utvecklas runt och stabilisera de insatta elektroder. Detta kan leda till förflyttning av de implanterade elektroder och opålitliga …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AB tacksam National Science Foundation för finansiering inom ramen för Cyber Physical Systems program (1239243) och Avdelningen för grundutbildningen (1245680); och Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) för att stödja tidigare stadier av detta arbete. Tidigare stadier av detta arbete utfördes av AB i Prof. Amit Lal laboratorium vid Cornell University. AB tack Ayesa Sinha och Prof. Lal för experimentell vägledning och idégenerering i det skedet. Manduca sexta (Linnaeus 1763) erhölls från en koloni upprätthålls av Institutionen för biologi vid Duke University, Durham, NC, USA. Malar användes inom fem dagar av eclosion. Vi vill tacka Triangle Biosystems International, särskilt David Juranas och Katy Millay för deras utmärkta teknisk hjälp och användning av deras Neuroware systemet. Vi vill också tacka Will Caffey för hans hjälp under experimenten.
Materials
| Coated stainless steel wire | A-M Systems | 791900 | 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed |
| Flexible electrode wire | Litz or inductor wire can be used. | ||
| Surface-mount FFC connector | Hirose Connector | FH28E-20S-0.5SH(05) | |
| Tweezers | Grobet USA | N/A | Clean with 70% alcohol before use on the insect. |
| Kim-Wipes | Kimberly-Clark Worldwide | 34155 | Any size delicate-wipe tissues can be used. |
| Teflon tape | N/A | N/A | 5 mm width Teflon tape. |
| Hypodermic Needle | Becton Dickinson & Co. | 30511 | 20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge. |
| Rigid Fixation Stick | N/A | N/A | Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers) |
| Insect Emergence Cage | N/A | N/A | Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed. |
| Thermal Cauterizer | Advanced Meditech International | CH-HI CT2103 (tip) | Optional equipment used for application of dental wax. |
| Dental Wax | Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma | N/A | Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect. |
| Magnetic Levitation Platform | N/A | N/A | Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping |
| CA40 Instant Adhesive | 3M | 62-3803-0330-5 | Avoid skin contact. Use gloves when handling. |
| 70% Isopropyl alcohol | store brand | Commercially available from many suppliers. | |
| PCB Etchant | RadioShack | 276-1535 | Toxic if swallowed or ingested, skin irritant |
| EQUIPMENT: | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| TBSI Neuroware Software | Triangle Biosystems International | N/A | NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html |
| TBSI Wireless Recording System | Triangle Biosystems International | W5 FI | USB Base station, headstage unit, charger |
| 16 Channel Amplifier A-C Amplifier | A-M Systems | 950000 | Model 3500 (110 V) |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DSO1014A | Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel |
| Microscope | N/A | N/A | 5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction. |
| Ultrasonic Cleaner | ColeParmer | EW-08848-10 | Ultrasonic Cleaner with Timer, |
References
- Taubes, G. Biologists and engineers create a new generation of robotics that imitate life. Science. 288 (7), 80-83 (2000).
- Duch, C., Bayline, R. J., Levine, R. B. Postembryonic development of the dorsal longitudinal flight muscle and its innervation in Manduca sexta. Journal of Comparative Neurology. 422 (1), 1-17 (2000).
- Levine, R. B., Morton, D. B., Restifo, L. L. Remodeling of the insect nervous system. Current opinion in neurobiology. 5 (1), 28-35 (1995).
- Williams, C. M. Physiology of insect diapause: the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm Platysamia cecropia. Bio. Bull. 90, 234-243 (1946).
- Williams, C. M. The juvenile hormone. II. Its role in the endocrine control of molting, pupation, and adult development in the Cecropia silkworm. Bio. Bull. 121, 572-585 (1961).
- Bozkurt, A., Lal, A., Gilmour, R. Radio control of insects for biobotic domestication. 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering. , 215-218 (2009).
- Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. In vivo electrochemical characterization of a tissue–electrode interface during metamorphic growth. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (8), 2401-2406 (2011).
- Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. Insect–machine interface based neurocybernetics. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1727-1733 (2009).
- Chapman, R. F. . The Insects: Structure and Function. , (1998).
- Eaton, J. L. Morphology of the head and thorax of the adult tobacco hornworm, Manduca sexta (Lepidoptera:Sphingidae). I. Skeleton and muscles. Annals of the Entomological Society of America. 64, 437-445 (1971).
- Resier, M. B., Dickinson, M. H. A modular display system for insect behavioral neuroscience. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 127-139 (2008).
- Dombeck, D. A., Reiser, M. B. Real neuroscience in virtual worlds. Current opinion in neurobiology. 22 (1), 3-10 (2011).
- Weir, P. T., Dickinson, M. H. Flying drosophila orient to sky polarization. Current Biology. 22 (1), 21-27 (2012).
- Ristroph, L., Bergou, A. J., et al. Discovering the flight autostabilizer of fruit flies by inducing aerial stumbles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4820-4824 (2010).
- Strauss, R., Schuster, S., Götz, K. G. Processing of artificial visual feedback in the walking fruit fly Drosophila melanogaster. The Journal of experimental biology. 20 (9), 1281-1296 (1997).
- Lindemann, J., Kern, R., Michaelis, C., Meyer, P., van Hateren, J., Egelhaaf, M. FliMax, a novel stimulus device for panoramic and highspeed presentation of behaviourally generated optic flow. Vision Research. 43 (7), 779-791 (2003).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. H. A modular display system for insect behavioral neuroscience. Journal of neuroscience methods. 167 (2), 127-139 (2008).
- Bozkurt, A., Gilmour, R. F., Lal, A. Balloon-assisted flight of radio-controlled insect biobots. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (9), 2304-2307 (2009).
