Langsiktig Behavioral Sporing av frittsvømmende Weakly Electric Fish

Summary

Vi beskriver et sett med teknikker for å studere spontan oppførsel av frittsvømmende svakt elektrisk fisk over en lengre tidsperiode, ved synkront å måle dyrets elektriske organ utladning timing, kroppsstilling og sittestilling både nøyaktig og pålitelig i et spesielt konstruert akvarium tanken i en sensorisk isolasjonskammer.

Abstract

Langsiktig atferds sporing kan fange opp og kvantifisere naturlige dyreatferd, inkludert de som forekommer sjelden. Atferd som leting og sosiale interaksjoner kan best studeres ved å observere hemningsløs, fritt oppfører dyr. Svakt elektrisk fisk (WEF) skjerm lett observerutforskende og sosial atferd ved å sende ut elektrisk orgel utladning (EOD). Her beskriver vi tre effektive teknikker for å måle synkront EOD, kroppsstilling, og holdning av en frittsvømmende WEF i en lengre tidsperiode. Først beskrives konstruksjonen av en eksperimentell tank inne i en isolert kammer utformet for å hindre eksterne kilder til sensoriske stimuli slik som lys, lyd og vibrasjon. Akvariet ble partisjonert å huse fire testprøver, og automatiserte porter fjernstyre dyrenes tilgang til den sentrale arena. Deretter beskriver vi en presis og pålitelig sanntids EOD timing målemetode fra frittsvømmende WEF. Signal forvrengninger forårsaket av dyrets kroppsbevegelser blir korrigert av rommessig gjennomsnittsføring og tidsprosesseringstrinn. Tredje, beskriver vi en undersjøisk nær-infrarød bildeoppsettet for å observere uaffisert nattlige dyreatferd. Infrarøde lyspulser ble brukt til å synkronisere tidsberegningen mellom video-og fysiologisk signal over et langt opptak varighet. Vår automatisert sporing måler dyrets kropp posisjon og holdning pålitelig i et vann scene. Sammen er disse teknikkene muliggjøre langvarig observasjon av spontan oppførsel av frittsvømmende svakt elektrisk fisk på en pålitelig og nøyaktig måte. Vi tror at vår metode kan være like anvendes i studiet av andre akvatiske dyr ved å knytte sine fysiologiske signaler med utforskende eller sosial atferd.

Introduction

Bakgrunn. Kvantitative eksperimenter på dyrs atferd (f.eks tvunget valg, sjokk unngåelse, T-labyrint, etc.) Er vanligvis brukt til å undersøke spesifikke hypoteser om sensorisk-motoriske ferdigheter, læring og hukommelse formasjon. Men disse restriktive eksperimenter gå glipp av mye av den rikdom av naturlige dyrs atferd og vil trolig føre til forenklede modeller av den underliggende nevrale grunnlaget for atferd. Eksperimenter under mer naturalistiske forholdene er derfor et viktig supplement som vi kan utforske mer fullstendig en art atferdsrepertoar. Forsøk med fritt bevegelige dyr må imidlertid ta unike tekniske utfordringer som bevegelsesutløst innspilling gjenstander. I motsetning til tiltaks-fremkalt respons, kan spontant forekommende utforskende atferd ikke forutsies, og dermed eksperimentelle fag må være konstant overvåket og spores over en lengre periode. Konkrete problemstillinger can være best ivaretatt av nøye utvalgte organismer og tilgjengelige tekniske verktøy. For eksempel, har optisk opptak og stimuleringsteknikker som for eksempel genetisk kodet kalsium sensorer ¹ og optogenetics ^to blitt brukt til fritt å bevege genetiske modellorganismer ^3-5. Alternativt kan miniatyriserte nevrale telemetrisystemer ta opp og stimulere fritt bevegelige smådyr ^6,7.

Elektrisk fisk. WEF arter generere elektrisk orgel utslipp (EODs), som tillater dem å oppfatte sine umiddelbare omgivelser eller for å kommunisere over større avstander. Temporale mønstre av EODs variere under ulike forhold, for eksempel selv bevegelser ^8,9, sensoriske stimuli ^10,11 og sosiale interaksjoner ^12,13. Puls-type WEF arter produserer et tog av diskrete pulser, i motsetning til bølgelignende art som genererer kontinuerlige kvasi-sinusformet bølgeformer. Generelt puls-typen arter utstillings more variabel EOD hastighet i forhold til bølgelignende arter, og dyrenes EOD priser tett reflektere nyhet innholdet i sine sanse omgivelser ^10,14. Puls-type arter kan umiddelbart forkorte inter-puls intervall (IPI) innenfor en enkelt puls syklus I reagere på en roman sensorisk forstyrrelse (nyhet respons ^10,11,14). Den pågående elektriske oppførselen til disse fiskene kan bli opprørt av ukontrollerte sensoriske stimuli fra eksterne kilder, og ulike typer stimuli som for eksempel vibrasjoner, lyd, elektrisitet, og lys er kjent trigger nyhet svar. Derfor må det tas spesielle forholdsregler for å blokkere eller dempe eksterne sensoriske stimuli under en langsiktig observasjon av frittsvømmende WEF. På denne måten kan endringer i EOD hastighet og bevegelsesbaner oppføres som stimuli presentert av eksperimentator.

Akvarium tank og isolasjon kammeret. Vi la derfor flere lag med vibrasjonsdempende materiale under et stort akvarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), og omgitt tanken med en isolert kabinett for å blokkere eksterne lyskilder, elektrisk støy, lyd og varme flux. EOD frekvens avhenger av den omliggende temperatur ^15,16, slik at vanntemperaturen er strengt regulert på en tropisk område (25 ± 1 ° C) for South American WEF arter. Vi bygget en stor og grunn (10 cm vanndybde) tank å observere romlige utforskende atferd av WEF hovedsak begrenset i to dimensjoner (Figur 1a). Tanken ble delt opp i en sentral arena for å observere romlige atferd, og fire hjørnelommer for å huse hver enkelt fisk (figur 1B). Hver rommet ble bygget vanntett for å hindre elektrisk kommunikasjon mellom individer. Dyr adgang til den sentrale arena ble kontrollert fra utsiden ved hjelp av fire motoriserte porter. Portene ble plassert mellom avdelingene, og de ble vanntett når den er låstav nylon vingemuttere. Ingen metalldeler ble brukt under vann siden WEF reagerer følsomt til metaller.

EOD-opptak. EODs er generert på en stereotyp måte ved aktivering av single (i Mormyrids) eller flere romlig distribuerte elektriske organer (i Gymnotiforms) ^17,18. Temporale modulasjoner i EOD hastigheten kan avsløre høyere nivå nevrale aktiviteter, siden den medullary pacemaker mottar direkte nevrale innspill fra høyere hjerneregioner som den diencephalic prepacemaker kjernen, som igjen får aksonale anslag fra brain ^19. Imidlertid må den EOD timing nøye hentet fra en rå bølgeform opptak og ikke partisk av dyrets bevegelsesutløst forvrengninger. Det elektriske felt som genereres av en WEF kan tilnærmes som en dipol, og dermed EOD puls amplituder ved opptakselektroder er avhengig av de relative avstander og orienteringer mellom dyret og elektrodene ^8,20. Animal selv movements endre den relative geometri mellom dyret og elektrodene, og dermed bevegelser føre de EOD amplituder på forskjellige elektroder til å variere med tiden i et flyktig måte (se figur 2B i juni et al. ^8). Videre selv bevegelser også endre formen på innspilte EOD bølgeformer, fordi relative bidrag fra ulike sett av de elektriske organene er avhengige av sine steder langs kroppslengde og deres lokale kurva introdusert av halen bøying. Bevegelses-indusert forvrengninger i EOD amplituder og former kan føre til unøyaktige og upålitelige EOD timing målinger. Vi overvant disse problemene ved romlig gjennomsnitt flere EOD-bølgeformer registrert på forskjellige steder, og ved å legge en konvolutt utvinning filter for å nøyaktig fastslå EOD timing fra et frittsvømmende WEF. I tillegg er våre teknikken måler også de EOD amplituder, som viser om et dyr hviler eller aktivt flytting basert på endringen av EODamplituder over tid (se figurene 2E og 2F). Vi registrerte ulikt forsterkede signaler fra innspillingen elektrode parene å redusere common-mode støy. Siden EOD pulser er generert med ujevne mellomrom, EOD hendelsestidsserien har en variabel samplingsfrekvens. EOD tidsserier kan konverteres til en konstant samplingsfrekvens ved interpolering hvis det kreves av en analytisk verktøy av valget.

Videoopptak. Selv EOD opptak kan overvåke en grov bevegelsesaktivitet hos et dyr, tillater videoopptak direkte målinger av dyrets kroppsstilling og sittestilling. Nær-infrarødt (NIR) belysning (λ = 800 ~ 900 nm) tillater uaffisert visuell observasjon av frittsvømmende fisk ^21,22, ettersom WEFs er mest aktive i mørke og deres øyne er ikke følsomme for NIR spekteret ^23,24. De fleste digitale bildesensorer (f.eks CMOS eller CCD) kan fange NIR spekteret med wavelength range mellom 800-900 nm, etter å ha fjernet en infrarød (IR) blokkerer filteret ^25. Enkelte high-end forbruker-grade webkameraer tilbyr high-definition, bred visningsvinkel og god lav-lysfølsomhet, noe som kan gi en bildekvalitet sammenlignes med, eller bedre enn profesjonelt nivå IR-kameraer som er tilgjengelige på langt større kostnader. I tillegg er enkelte forbruker-grade webkameraer buntet med innspillingen programvare som tillater en lengre opptakstid ved å komprimere video uten tap av kvalitet. De fleste profesjonelle-klasse kameraer tilbyr tidssynkronisering TTL pulsutganger eller trigger TTL pulsinnganger ²⁶ for å justere timingen mellom videoen med de digitaliserte signaler, men denne funksjonen er vanligvis fraværende i forbruker-grade webkameraer. Men, kan timingen mellom en videoinnspilling og et signal digitaliserer være nøyaktig matchet ved samtidig å fange en blinkende jevne IR LED med kameraet og signalet digitaliserer. Den første og den siste puls IR timing kan benyttes ens to markører tidskalibrerings for omforming av videorammenummer til signal digitaliserer tidsenhet, og omvendt.

Lighting & bakgrunn. Ta bilder gjennom vann kan være teknisk utfordrende på grunn av lysrefleksjoner på vannoverflaten. Vannflaten kan fungere som et speil for å reflektere en visuell scene over vann, og obskure visuelle funksjoner under vann, og dermed scenen over vann må gjengis særpreg for å hindre visuell forstyrrelse. For å avbilde hele akvarium, må et kamera for å bli plassert direkte over vannet, og det bør være skjult bak taket over et lite visning hullet for å hindre at dens refleksjon på vannflaten. Videre kan vannoverflaten produsere stirrer og nonuniform belysning hvis lyskilder er feil anslått. Indirekte belysning kan oppnå en jevn lyshet over hele akvariet ved å sikte lyskildene mot taket, slik at den omkringliggende wal taket ogls kan reflektere og diffuse lyset stråler før den når vannflaten. Velg en IR-lys som passer til en spektral respons på kameraet (f.eks 850 nm peak bølgelengde). Elektrisk støy fra lyskildene kan reduseres ved å bruke LED-lys og plassere sine DC strømforsyning utenfor Faraday bur. Plasser en hvit bakgrunn under tanken, siden fisken kontraster godt i en hvit bakgrunn på NIR bølgelengder. Tilsvarende bruk av matt hvit farge på den indre overflaten av isolasjonskammeret gir ensartet og sterkt bakgrunnsbelysningen.

Video sporing. Når en video-opptak, kan en automatisert bildesporingsalgoritme måle dyrets kroppsposisjoner og stillinger over tid. Videoen sporing kan utføres automatisk ved enten klar til bruk programvare (Viewpoint eller Ethovision), eller bruker-programmerbar programvare (OpenCV eller MATLAB Bildebehandling verktøykasse). Som første skritt i bilde sporing,et gyldig sporings området må defineres ved å tegne en geometrisk form å ekskludere området utenfor (maskeringsoperasjon). Deretter må en dyrets bilde som skal isoleres fra bakgrunnen ved å subtrahere bakgrunnsbilde fra et bilde inneholdende dyret. Den subtrahert bilde blir omdannet til et binært format ved å bruke et intensitetsterskel, slik at det geometriske tyngdepunkt og retningen aksen kan beregnes fra binære morfologiske operasjoner. I Gymnotiforms ^27-29 og Mormyrids ^30-32, er den electroreceptor tettheten størst i nærheten av hoderegionen, og dermed hodeposisjonen til enhver tid angir en plassering av den høyeste sanseskarphet. Hodet og halen steder kan bestemmes automatisk ved å bruke bilderote og markerings-box drift. De fremre og bakre ender kan skilles fra hverandre ved manuelt å definere dem i den første ramme, og ved å holde rede på sine steder fra å sammenligne to suksessive rammer.

Protocol

Denne prosedyren oppfyller kravene i University of Ottawa Animal Care Committee. Ingen interessekonflikt er deklarert. Vennligst referer til Table of Materials og reagenser for fabrikater og modeller av utstyr og materialer som er oppgitt nedenfor. Custom skrevet Spike2 og MATLAB skript, og eksempeldata er gitt i brev fil. En. Aquarium Tank og Isolasjon Kammer Setup Anti-v ibration gulvet. Konstruer en anti-vibrasjonsflate (2,1 mx 2,1 m) ved å stable gummiputer, akustisk…

Representative Results

EOD sporingsresultatene De registrerte EOD bølgeformer fra forskjellige elektrode parene variert i amplituder og former som forventet fra sine unike posisjoner og orienteringer (Figur 2C øverst). Bruken av flere elektrode parene sikres sterkt signalmottak til alle mulige posisjoner og orienteringer av WEF i tanken. Konvolutten bølgeform (Figur 2C bunnen, grønne kurven) alltid inneholdt en enkel topp per EOD syklus, som fungerte som en pålitelig tidsmarkør…

Discussion

Betydningen av våre teknikker. Oppsummert vi først beskrevet byggingen av et stort akvarium tank og et isolert kammer å observere spontane utforskende atferd produsert av WEF. Deretter viste vi teknikken med å samle inn og spore EOD hastigheten og bevegelsen statene fra uhemmet fisk i sanntid ved hjelp av flere elektrode parene. Endelig beskrev vi den infrarøde videoopptak teknikk gjennom vannet i en tid-synkronisert måte, og bildet sporingsalgoritme for å måle kroppsstilling og sittestilling. Som en ek…

Materials

			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter – 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox