Seguimiento del comportamiento a largo plazo de Libremente Natación débilmente eléctrico Fish

Summary

Se describe un conjunto de técnicas para el estudio de la conducta espontánea de nadar libremente peces débilmente eléctrica durante un período prolongado de tiempo, de forma sincrónica medir el tiempo de descarga de órgano eléctrico del animal, la posición del cuerpo y la postura tanto de forma precisa y fiable en un tanque del acuario especialmente diseñado dentro de un sensorial cámara de aislamiento.

Abstract

Seguimiento del comportamiento a largo plazo puede capturar y cuantificar las conductas animales naturales, incluyendo las que ocurren con poca frecuencia. Conductas tales como la exploración y las interacciones sociales pueden ser mejor estudiados mediante la observación, los animales comportarse libremente sin restricciones. Peces eléctricos débilmente (WEF) de visualización exploratoria fácilmente observables y el comportamiento social mediante la emisión de descarga órgano eléctrico (EOD). A continuación, describimos tres técnicas eficaces para medir de forma sincrónica los Tedax, la posición del cuerpo y la postura de un WEF nadan libremente durante un período prolongado de tiempo. En primer lugar, se describe la construcción de un tanque experimental en el interior de una cámara de aislamiento diseñado para bloquear las fuentes externas de estímulos sensoriales como la luz, el sonido y la vibración. El acuario se dividió para dar cabida a cuatro especímenes de ensayo, y barreras automáticas controlar remotamente el acceso de los animales a la arena central. En segundo lugar, se describe un método preciso y fiable en tiempo real de medición de tiempo del EOD de nadar libremente WEF. Distorsiones de la señal causadas por los movimientos del cuerpo del animal se corrigen por promediado espacial y etapas de procesamiento temporal. En tercer lugar, se describe una configuración de imagen en el infrarrojo cercano bajo el agua para observar comportamientos de los animales nocturnos no perturbadas. Pulsos de luz de infrarrojos se utilizan para sincronizar la temporización entre el vídeo y la señal fisiológica a través de una duración de la grabación de largo. Nuestro software de seguimiento automatizado mide la posición del cuerpo del animal y la postura de forma fiable en una escena acuática. En combinación, estas técnicas permiten la observación a largo plazo de la conducta espontánea de nadar libremente peces débilmente eléctrica de una manera fiable y precisa. Creemos que nuestro método se puede aplicar de manera similar al estudio de otros animales acuáticos, relacionando sus señales fisiológicas con comportamientos exploratorios o sociales.

Introduction

Antecedentes. Experimentos cuantitativos sobre el comportamiento animal (por ejemplo, elección forzada, evitación de shock, laberinto en T, etc.) Se utilizan normalmente para investigar las hipótesis específicas relativas a las habilidades sensoriales y motoras, el aprendizaje y la formación de la memoria. Sin embargo, estos experimentos restrictivas se pierda gran parte de la riqueza del comportamiento natural de los animales, y es probable que resulte en modelos simplistas de la base neural subyacente de comportamiento. Los experimentos en condiciones más naturales son, por tanto, un complemento importante por el cual podemos explorar más a fondo el repertorio conductual especies. Los experimentos con animales se mueven libremente deben, sin embargo, frente a los desafíos técnicos únicos, tales como artefactos de grabación inducidas por movimiento. A diferencia de las respuestas de estímulo evocado, que se producen de manera espontánea el comportamiento exploratorio no se pueden predecir, por lo que los sujetos experimentales tienen que ser controlados y seguidos durante un período prolongado de tiempo constante. Las preguntas específicas de investigación can ser mejor abordados por organismos cuidadosamente seleccionados y las herramientas técnicas disponibles. Por ejemplo, las técnicas de registro y estimulación ópticos tales como sensores de calcio genéticamente codificados en ¹ y ² optogenética se han aplicado con éxito para moverse libremente organismos modelos genéticos ^3-5. Por otra parte, los sistemas de telemetría neuronales miniaturizados pueden grabar y estimular que se mueve libremente animales pequeños ^6,7.

Peces Electric. Especies WEF generan descargas eléctricas de órganos (EODs), que les permiten percibir su entorno inmediato o para comunicarse a grandes distancias. Los patrones temporales de EODs varían bajo diferentes condiciones tales como auto-movimientos ^8,9, estímulos sensoriales ^{10,11, 12,13} y las interacciones sociales. Especies WEF de tipo Pulso producen un tren de pulsos discretos, en lugar de especies de tipo de onda a la que generan formas de onda cuasi sinusoidal continua. En general, de tipo pulso exhiben especies more Tasa EOD variables en comparación con las especies de tipo de onda, y las tasas de eliminación de artefactos explosivos de los animales refleja de cerca el contenido de la novedad de su entorno sensorial ^10,14. Especies de tipo de pulso pueden reducir de inmediato el intervalo entre pulsos (IPI) en un solo ciclo de pulso en responder a una perturbación sensorial novela (respuesta novedad ^10,11,14). El comportamiento eléctrico continuo de estos peces puede ser perturbado por los estímulos sensoriales no controladas procedentes de fuentes externas, y diferentes tipos de estímulos tales como la vibración, el sonido, la electricidad y la luz son conocidas las respuestas de la novedad de activación. Por lo tanto, se deben tomar precauciones especiales para impedir o atenuar los estímulos sensoriales externos durante una observación a largo plazo de nado libre WEF. De esta manera, los cambios en la tasa de EOD y trayectorias de movimiento pueden ser atribuidos específicamente a los estímulos presentados por el experimentador.

Tanque de acuario y cámara de aislamiento. Por lo tanto, colocamos varias capas de materiales de absorción de vibraciones under un tanque del acuario grande (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), y rodearon el tanque con un recinto aislado para bloquear las fuentes externas de luz, ruido eléctrico, el sonido y el flujo de calor. Tasa de EOD depende de la temperatura que rodea ^15,16, por lo tanto la temperatura del agua fue estrechamente regulada en un intervalo de tropical (25 ± 1 ° C) para las especies de Sur América WEF. Construimos un (10 cm de profundidad de agua) tanque grande y poco profunda para observar conductas exploratorias espaciales del WEF restringidas principalmente en dos dimensiones (Figura 1A). El tanque se repartió en una pista central para observar comportamientos espaciales, y cuatro compartimentos de esquina para albergar por separado cada pez (Figura 1B). Cada compartimiento estanco fue construida para impedir la comunicación eléctrica entre los individuos. Acceso Animals 'a la arena central estaba controlada desde el exterior por cuatro compuertas motorizadas. Las puertas se colocaron entre los compartimentos, y se convirtieron hermético cuando está bloqueadopor nylon alas nueces. No hay partes metálicas se utilizaron bajo el agua desde WEF reaccionan sensiblemente a los metales.

Grabación EOD. EODs se generan de una manera estereotipada por la activación de un solo (en Mormyrids) o múltiples órganos eléctricos distribuidos espacialmente (en Gymnotiforms) ^17,18. Modulaciones temporales en la tasa del EOD pueden revelar las actividades neuronales de nivel superior, ya que el marcapasos medular recibe entradas neuronales directos de las regiones superiores del cerebro, tales como el núcleo prepacemaker diencefálico, que a su vez recibe las proyecciones axonales de la cerebro anterior ^19. Sin embargo, el momento del EOD debe ser cuidadosamente extraída de una grabación de forma de onda en bruto y no sesgada por las distorsiones inducidas por movimiento del animal. El campo eléctrico generado por una FEM se puede aproximar como un dipolo, por lo EOD amplitudes de pulso en electrodos de registro dependen de las distancias y orientaciones relativas entre el animal y los electrodos de ^8,20. Auto-movem del Animalpadres cambian la geometría relativa entre el animal y los electrodos, por lo tanto los movimientos causan las amplitudes EOD en diferentes electrodos para varían con el tiempo de una manera volátil (véase la Figura 2B en Junio ​​et al. ^8). Por otra parte, auto-movimientos también cambian la forma de onda EOD grabadas, porque las contribuciones relativas de diferentes conjunto de los órganos eléctricos dependen de sus ubicaciones a lo largo de la longitud del cuerpo y sus curvaturas locales introducida por la flexión de la cola. Las distorsiones inducidas por movimiento en las amplitudes y formas EOD pueden conducir a mediciones de tiempo EOD imprecisas y no fiables. Hemos superado estos problemas espacialmente promediando múltiples formas de onda de desactivación de artefactos explosivos registrados en distintos lugares, y añadiendo un filtro de extracción de sobres para determinar con precisión el momento del EOD de una FEM de nado libre. Además, nuestra técnica también mide las amplitudes de desactivación de artefactos explosivos, que indican si un animal está en reposo o moviéndose activamente basándose en el cambio de la EODamplitudes en el tiempo (véanse las figuras 2E y 2F). Se registraron señales diferencialmente amplificados a partir de los pares de electrodos de grabación para reducir el ruido de modo común. Dado que los pulsos de desactivación de artefactos explosivos se generan a intervalos de tiempo irregulares, el evento de series de tiempo EOD tiene una frecuencia de muestreo variable. El tiempo-serie del EOD se puede convertir a una velocidad de muestreo constante por interpolación si es requerido por una herramienta analítica de elección.

La grabación de vídeo. Aunque la grabación EOD puede supervisar una actividad de movimiento bruto de un animal, la grabación de vídeo permite la medición directa de la posición del cuerpo de un animal y la postura. Infrarrojo cercano (NIR) Iluminación (λ = 800 ~ 900 nm) permite imperturbable observación visual de nadar libremente peces ^21,22, ya WEFs son más activos en la oscuridad y sus ojos no son sensibles al espectro NIR ^23,24. La mayoría de los sensores de imagen digital (por ejemplo, CMOS o CCD) pueden capturar el espectro NIR con la wavelength rango entre 800-900 nm, después de la eliminación de un puerto de infrarrojos (IR) de filtro de bloqueo ^25. Ciertas webcams de nivel de consumidor de gama alta ofrecen alta definición, ángulo de visión amplio y una buena sensibilidad con poca luz, lo que puede producir una calidad de imagen comparable a, o superior a cámaras de infrarrojos de calidad profesional disponible a costos mucho mayores. Además, ciertos webcams de nivel de consumidor se incluyen con el software de grabación que permite un tiempo de grabación prolongado al comprimir vídeo sin pérdida de calidad. La mayoría de cámaras de nivel profesional ofrecen sincronización TTL salidas de impulsos de tiempo o entradas de pulsos TTL de disparo ²⁶ para alinear la sincronización entre el vídeo con las señales digitalizadas, pero esta característica es generalmente ausente en webcams de nivel de consumidor. Sin embargo, la temporización entre una grabación de vídeo y un digitalizador de señal se puede emparejar con precisión mediante la captura simultáneamente un IR LED parpadea periódicamente con la cámara y el digitalizador de señal. El momento inicial y la final del pulso IR se puede utilizar unas de dos marcadores de calibración de tiempo para convertir los números de fotogramas de vídeo a la unidad de tiempo digitalizador de señal y viceversa.

Iluminación y fondo. Imagen capturar a través del agua puede ser un desafío técnico debido a reflejos de luz en la superficie del agua. La superficie del agua puede actuar como un espejo para reflejar una escena visual por encima del agua, y las características visuales oscuros bajo el agua, por lo que la escena fuera del agua debe dictarse sin rasgos para evitar la interferencia visual. Con el fin de imagen todo el acuario, una cámara tiene que ser colocado directamente sobre el agua, y que debe estar oculto detrás del techo sobre un orificio de visualización pequeño para evitar su reflexión sobre la superficie del agua. Por otra parte, la superficie del agua puede producir miradas y la iluminación no uniforme si las fuentes de luz se proyectan de forma incorrecta. La iluminación indirecta puede lograr una iluminación uniforme sobre toda el acuario por objetivo las fuentes de luz hacia el techo, de tal manera que el techo y el Wal rodeals pueden reflejar y difundir los rayos de luz antes de llegar a la superficie del agua. Elija un iluminador de infrarrojos que coincide con una respuesta espectral de la cámara (por ejemplo, 850 nm de longitud de onda de pico). Ruido eléctrico de las fuentes de luz puede ser minimizado mediante el uso de luces LED y la colocación de sus fuentes de alimentación de corriente continua fuera de la jaula de Faraday. Coloque un fondo blanco debajo del tanque, ya que los peces contrasta bien en un fondo blanco en longitudes de onda NIR. Del mismo modo, el uso del color blanco mate en las superficies interiores de la cámara de aislamiento proporciona uniforme y brillante iluminación de fondo.

Seguimiento de vídeo. Después de una grabación de vídeo, un algoritmo de seguimiento automatizado de imágenes puede medir posiciones y posturas del cuerpo del animal con el tiempo. El seguimiento de vídeo se puede realizar de forma automática, ya sea software listo para usar (Viewpoint o Ethovision), o software programable por el usuario (OpenCV o MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imagen). Como el primer paso de seguimiento de imagen,un área de seguimiento válido tiene que ser definido por dibujar una forma geométrica para excluir la zona exterior (enmascarar la operación). A continuación, la imagen de un animal tiene que ser aislado del fondo restando una imagen de fondo de una imagen que contiene el animal. La imagen de la resta se convierte a un formato binario mediante la aplicación de un umbral de intensidad, de manera que el centroide y el eje de orientación se pueden calcular a partir de las operaciones morfológicas binarias. En Gymnotiforms ^27-29 y ^30-32 Mormyrids, la densidad electroreceptor es la más alta cerca de la región de la cabeza, por lo que la posición de la cabeza en cualquier momento indica una ubicación de la más alta agudeza sensorial. Los lugares de la cabeza y de la cola se pueden determinar de forma automática mediante la aplicación de las operaciones de rotación de imagen y de cuadro de límite. Los extremos de cabeza y cola se pueden distinguir uno del otro definiendo manualmente en el primer fotograma, y ​​por hacer el seguimiento de sus ubicaciones de la comparación de dos tramas sucesivas.

Protocol

Este procedimiento cumple con los requisitos de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Ottawa. Ningún conflicto de interés se declara. Por favor, consulte la Tabla de Materiales y Reactivos para las marcas y modelos de los equipos y materiales que figuran a continuación. Escritos Custom Spike2 y MATLAB scripts y datos de ejemplo se proporcionan en el archivo suplementario. 1. El tanque del acuario y de la Cámara de aislamiento Configuración Anti-v piso ibrati…

Representative Results

Seguimiento de los resultados del EOD Las formas de onda EOD grabadas de diferentes pares de electrodos varían en amplitud y las formas como se esperaba de sus posiciones únicas y orientaciones (Figura 2C arriba). El uso de múltiples pares de electrodos garantiza fuerte recepción de la señal en todas las posiciones posibles y las orientaciones de FEM dentro del tanque. La forma de onda envolvente (Figura 2C parte inferior, verde rastro) siempre contenía u…

Discussion

Importancia de nuestras técnicas. En resumen, se describió por primera vez la construcción de un gran tanque de acuario y una cámara de aislamiento para observar comportamientos exploratorios espontáneas producidas por WEF. A continuación, se demostró la técnica de registrar y hacer un seguimiento de la tasa de EOD y los estados de movimiento de los peces sin restricciones en tiempo real, utilizando múltiples pares de electrodos. Finalmente, describimos la técnica de infrarrojos de grabación de víde…

Materials

			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter – 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox