Vi beskriver en uppsättning tekniker för att studera spontana beteende fritt simma svagt elektriska fiskar under en längre tid, genom att synkront mäta djurets elektrisk urladdning organ timing, kroppsställning och hållning både exakt och tillförlitligt i en specialdesignad akvarium tanken inne i en sensorisk isoleringskammare.
Långsiktiga beteende spårning kan fånga och kvantifiera naturliga djurbeteenden, inklusive de som förekommer sällan. Beteenden såsom prospektering och sociala interaktioner kan bäst studeras genom att observera ohämmad, fritt beter djur. Svagt elektriska fiskar (WEF) display tydligt observer undersökande och sociala beteenden genom att släppa ut elorgel urladdning (EOD). Här beskriver vi tre effektiva tekniker för att synkront mäta EOD, kroppsposition, och hållning av en fritt simmande WEF under en utsträckt tidsperiod. Först beskriver vi byggandet av en experimentell tank inne i en isoleringskammare för att blockera externa källor av sensoriska stimuli som ljus, ljud och vibrationer. Akvariet delades för att rymma fyra provkroppar, och automatiska dörrar fjärrstyra djurens tillgång till den centrala arenan. För det andra, beskriver vi en exakt och tillförlitlig realtids EOD timing mätmetod från att fritt simma WEF. Signal snedvridningar orsakade av djurets kroppsrörelser korrigeras med rumslig medelvärdes och tidssteg bearbetning. För det tredje, beskriver vi en undervattens nära infraröd avbildning setup för att observera ostörda nattliga djurbeteenden. Infraröd ljuspulser användes för att synkronisera tiden mellan videon och den fysiologiska signalen under en lång inspelningstid. Vår automatiserad mjukvara mäter djurets kroppsställning och hållning tillförlitligt i en vattenscen. I kombination, dessa tekniker möjliggör långsiktig observation av spontana beteende fritt simma svagt elektriska fiskar på ett tillförlitligt och exakt sätt. Vi tror att vår metod kan tillämpas på samma sätt som studier av andra vattenlevande djur genom att relatera sina fysiologiska signaler med förberedande eller sociala beteenden.
Bakgrund. Kvantitativa experiment på djurens beteende (t.ex. tvångs val, chock undvikande, T-labyrinten, osv.) Är vanligtvis används för att undersöka specifika hypoteser rörande sensorisk-motoriska färdigheter, inlärning och minnesbildning. Dessa restriktiva experiment missar mycket av den rikedom av naturliga djurs beteende och kommer sannolikt att leda till överförenklade modeller av den underliggande neurala grunden för beteende. Experiment under mer naturalistiska förhållanden är därför ett viktigt komplement som vi kan utforska mer fullständigt en art beteenderepertoar. Försök med fritt rörliga djur måste dock ta itu med unika tekniska utmaningar som rörelseutlöst inspelning artefakter. Till skillnad från stimulans framkallade svar, kan spontant förekommande undersökande beteende inte förutsägas, och därför försökspersoner måste ständigt övervakas och spåras under en längre tid. Specifika forskningsfrågor can bäst hanteras genom noggrant utvalda organismer och tillgängliga tekniska verktyg. Till exempel optisk inspelning och stimuleringstekniker såsom genetiskt kodade kalcium givare 1 och optogenetics 2 har med framgång tillämpats på fritt rörliga genetiska modellorganismer 3-5. Alternativt kan miniatyriserade neurala telemetrisystem registrera och stimulera fritt rörliga smådjur 6,7.
Elektrisk fisk. WEF arter genererar elektriska urladdningar organ (EODS), som tillåter dem att känna sin närmiljö eller att kommunicera över större avstånd. Tidsmässiga mönster EODS varierar under olika förhållanden såsom själv rörelser 8,9, sensoriska stimuli 10,11 och sociala interaktioner 12,13. Pulstyp WEF arter producerar ett tåg av diskreta pulser, i motsats till våg-typ species som genererar kontinuerliga kvasi-sinusformade vågformer. I allmänhet pulstyp arter uppvisar More rörlig EOD takt i förhållande till arten wave-typ, och djurens EOD avgifterna speglar tätt nyhet innehållet i deras sensoriska omgivning 10,14. Puls-typ arter kan omedelbart förkorta interpulsintervall (IPI) inom en enda puls cykel som svar på en ny sensorisk störning (nyhet svar 10,11,14). Den pågående elektriska beteendet hos dessa fiskar kan störas av okontrollerade sensoriska stimuli från externa källor, och olika typer av stimuli som t.ex. vibrationer, ljud, elektricitet, och ljus är kända trigger nyhet svar. Därför måste speciella försiktighetsåtgärder vidtas för att blockera eller dämpa yttre sensoriska stimuli under en långvarig observation av frisimmande WEF. På detta sätt kan förändringar i EOD takt och rörelsebanor specifikt hänföras till stimuli som presenteras av försöksledaren.
Akvarium tank och isoleringskammaren. Vi placerade därför flera lager av vibrationsdämpande material under ett stort akvarium tank (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), och omges tanken med ett isolerat hölje för att blockera externa ljuskällor, elektriskt brus, ljud-och värmeflöde. EOD räntan beror på den omgivande temperaturen 15,16, alltså vattentemperaturen var hårt reglerad i ett tropiskt område (25 ± 1 ° C) för Sydamerikanskt WEF arter. Vi konstruerade en stor och grund (10 cm vattendjup) tank för att observera rumsliga undersökande beteenden av WEF huvudsakligen bundna i två dimensioner (Figur 1A). Tanken delades in i en central arena för att observera rumsliga beteenden, och fyra hörnfack till sig hysa fiskar (Figur 1B). Varje fack byggdes vattentätt för att förhindra elektrisk kommunikation mellan individer. Djur tillgång till den centrala arenan styrdes från utsidan med fyra motoriserade grindar. Grindarna placerades mellan facken, och de blev vattentäta när de låstmed nylonvingmuttrar. Inga metalldelar användes under vatten sedan WEF känsliga för metaller.
EOD inspelning. EODS genereras på ett stereotypt sätt genom aktivering av enstaka (i Mormyrids) eller flera rumsligt fördelade elektriska organ (i Gymnotiforms) 17,18. Temporal modulationer i EOD kurs kan avslöja neurala aktiviteter på högre nivå, eftersom märg pacemaker får direkt neurala input från högre hjärnregioner som diencephalic prepacemaker kärnan, som i sin tur tar emot axonal prognoser från framhjärnan 19. Dock måste EOD timing noggrant heras från en rå inspelning vågform och inte påverkade av djurets rörelse snedvridningar. Det elektriska fältet som genereras av en WEF kan approximeras som en dipol, alltså EOD pulsamplituder vid registreringselektroderna beror på de relativa avstånd och orienteringar mellan djuret och elektrod 8,20. Animal själv movement ändra den relativa geometrin mellan djuret och elektroderna och på så sätt rörelser orsaka EOD amplituder vid olika elektroderna för att variera över tiden i ett flyktigt sätt (se Figur 2B i juni et al. 8). Dessutom själv rörelser förändras också formen på inspelade EOD vågformer, eftersom de relativa bidragen från olika uppsättningar av de elektriska organen beroende av sina platser längs kroppslängden och deras lokala krök införts av svans böjning. Den rörelse-inducerad snedvridningar i EOD amplituder och former kan leda till felaktiga och otillförlitliga mätningar EOD timing. Vi har övervunnit dessa problem genom att rumsligt medelvärdes flera EOD vågformer inspelade på olika platser, och genom att lägga ett kuvert utvinning filter för att exakt bestämma EOD timing från en frisimmande WEF. Dessutom vår teknik mäter också de EOD amplituder, som indikerar huruvida ett djur ska vila eller aktivt flytta baserat på förändringen av EODamplituder över tiden (se figur 2E och 2F). Vi spelade in differentiellt förstärkta signaler från inspelningen elektrodparen för att minska common mode-brus. Eftersom EOD pulser genereras med oregelbundna tidsintervall, EOD händelse tidsserier ha en variabel samplingshastighet. Den EOD tidsserier kan omvandlas till en konstant samplingsfrekvens genom interpolation om det krävs av ett analytiskt verktyg för val.
Videoinspelning. Även EOD inspelning kan övervaka en grov rörelse aktiviteten hos ett djur, tillåter videoinspelning direkta mätningar av ett djurs kroppsställning och hållning. Nära infraröda (NIR) ljus (λ = 800 ~ 900 nm) medger oberörd visuell observation av fritt simmande fiskar 21,22, eftersom WEFs är mest aktiva i mörker och deras ögon är inte känsliga för NIR-spektrum 23,24. De flesta digitala bildsensorer (t.ex. CMOS eller CCD) kan fånga NIR-spektrum med wavelength intervallet mellan 800 till 900 nm, efter avlägsnande av en infraröd (IR) spärrfilter 25. Vissa avancerade konsument-grade webbkameror erbjuder HD-, bred betraktningsvinkel och bra låg-ljuskänslighet, vilket kan ge en bildkvalitet som är jämförbar med, eller bättre än proffs IR-kameror som finns på mycket högre kostnader. Dessutom är vissa konsument-grade webbkameror levereras med inspelning mjukvara som tillåter en utökad inspelningstiden genom att komprimera video utan kvalitetsförlust. De flesta proffskameror erbjuder tidssynkronisering TTL pulsutgångar eller utlösa TTL pulsingångar 26 för inriktning timing mellan video med de digitaliserade signaler, men denna funktion är i allmänhet frånvarande i konsument-grade webbkameror. Däremot kan tidpunkten mellan en videoinspelning och en signal digitizer exakt motsvaras av samtidigt fånga ett periodiskt blinkande IR-LED med kameran och signal digitizer. Den ursprungliga och den slutliga IR puls timing kan användas ens två tidskalibreringsmarkörer för konvertering av video ramnummer till signal digitizer tidsenhet och vice versa.
Belysning & bakgrund. Bild fånga genom vatten kan vara tekniskt utmanande på grund av ljusreflexer vid vattenytan. Vattenytan kan fungera som en spegel för att reflektera en visuella scenen ovanför vattenytan, och dunkla visuella funktioner under vattnet, alltså scenen ovanför vattenytan skall smältas odefinierbar att förhindra visuell interferens. För att bilden hela akvariet, behöver en kamera som placeras direkt ovanför vattnet, och det ska vara dolt bakom taket över en liten visning hål för att förhindra dess reflektion på vattenytan. Dessutom kan vattenytan producera bligar och olikformig belysning om ljuskällor är felaktigt projiceras. Indirekt belysning kan uppnå en jämn ljusstyrka över hela akvariet genom att rikta ljuskällorna mot taket, så att taket och den omgivande walls kan reflektera och sprida ljusstrålarna innan det når vattenytan. Välj en IR-strålkastare som matchar spektrala känslighet på kameran (t.ex. 850 nm topp våglängd). Elektriska störningar från ljuskällorna kan minimeras genom att använda LED-lampor och placera sina DC nätaggregat utanför Faradays bur. Placera en vit bakgrund under tanken, eftersom fisk kontrast bra i en vit bakgrund på NIR-våglängder. På liknande sätt, användning av matt vit färg på de inre ytorna av isoleringskammaren ger jämn och ljus bakgrundsbelysning.
Video spårning. Efter en videoinspelning, kan en automatisk bild spårning algoritm mäter djurets kroppspositioner och ställningar över tid. Spårningen video kan automatiskt utföras av antingen färdiga att använda programvara (Viewpoint eller Ethovision) eller programmerbar programvara (OpenCV eller MATLAB Bildbehandling verktygslåda). Som ett första steg i bild-spårning,ett giltigt spårning område måste definieras genom att rita en geometrisk form för att utesluta området utanför (maskerings operation). Därefter behöver ett djurs bild för att vara isolerade från bakgrunden genom att subtrahera en bakgrundsbild från en bild innehållande djuret. Den subtraherade bilden omvandlas till ett binärt format genom att applicera en intensitet tröskel, så att tyngdpunkten och orienteringsaxeln kan beräknas från binära morfologiska operationer. I Gymnotiforms 27-29 och Mormyrids 30-32 är electroreceptor densitet högsta nära huvudet regionen, alltså huvudpositionen i varje ögonblick indikerar en placering av den högsta sensorisk skärpa. Huvud och svans platser kan automatiskt bestäms genom tillämpning av bildrotation och bounding-box verksamhet. Huvud och svans ändarna skulle kunna särskiljas från varandra genom att manuellt definiera dem i den första ramen, och genom att hålla reda på sina platser från att jämföra två på varandra följande ramar.
Betydelsen av våra tekniker. Sammanfattningsvis har vi beskrivit första uppförandet av ett stort akvarium tank och en isoleringskammare för att observera spontana undersökande beteenden som produceras av WEF. Därefter visade vi tekniken att spela in och spåra EOD takt och rörelsetillstånd från ohämmad fisk i realtid med hjälp av flera elektrodparen. Slutligen beskrev vi infraröd videoinspelning teknik genom vatten i en tid-synkroniserat sätt och bilden spårningsalgoritm för att mäta kroppsstäl…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick generöst stöd av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR).
[Aquarium construction] | |||
Electrically shielded floor heater | ThermoSoft Corp., IL, USA | ThermoTile | www.thermosoft.com |
Tempered glass panel | generic | .5 inch thick, used for the aquarium construction | |
Aquarium grade silicone | generic | ||
Acrylic sheet | generic | .25 inch thick, matt white | |
Natural rubber sheet | generic | .25 inch thick | |
Servomotor | HITECHRCD Inc., Korea | HS-325HB, 180deg rotation | www.servocity.com |
Servomotor arm mount | HITECHRCD Inc., Korea | 56362 Large Spline | www.servocity.com |
Servomotor controller (6 chan.) | sparkfun.com | ROB-09664 | Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller |
Active USB extension cable | C2G | 38990 | 12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable |
Exhaust fan | Nutone | ILFK120 | www.homedepot.com |
Vertical aquarium filter | Tetra, Germany | Whisper Internal Power Filter – 40i | |
Crushed coral | Used to increase the pH of the tank water | ||
[EOD recording setup] | |||
Graphite Electrodes | Staedtler, Germany | Mars Carbon 2-mm type HB | Shave the outer coating |
Physiological Amplifier/Filter | Intronix, Canada | 2015F | |
Coaxial Cable | generic | RG174 | For electrodes assembly |
Coaxial Cable | generic | RG54 | For wiring use |
BNC jack connector for RG-174 | Amphenol Connex | 112160 | For electrodes assembly |
BNC plug connector for RG-54 | Amphenol Connex | 112116 | For wiring use |
Signal digitizer hardware | Cambridge Electronic Design, UK | Power MKII 1401 | |
Signal digitizer software | Cambridge Electronic Design, UK | Spike 2. ver 7 | |
[Visual tracking setup] | |||
White LED light | IKEA, Sweden | DIODER 201.194.18 | www.ikea.com |
Infrared LED light (850 nm) | Scene Electronics, China | S8100-60-B/C-IR | Remove built-in fan |
USB webcam | Logitech Inc., CA, USA | C910 | Remove Infrared blocking filter |
Motorized camera | Logitech Inc., CA, USA | Quickcam Orbit | Remove Infrared blocking filter |
Video recording software | Logitech Inc., CA, USA | Logitech Quickcam Software | Download from www.logitech.com |
Matlab | Mathworks, MA, USA | 2012a | Image processing toolbox |