Biomolecular स्थानान्तरण प्रयोगों के लिए समाधान में ठोस राज्य nanopores तैयार करने के लिए एक पद्धति को प्रस्तुत किया है. उच्च बिजली क्षेत्र दालों की कमी को लागू करके, nanopore व्यास controllably subnanometer परिशुद्धता के साथ विस्तारित किया जा सकता है और अपने बिजली के शोर विशेषताओं में काफी सुधार हुआ. यह प्रक्रिया प्रयोगात्मक शर्तों के तहत मानक प्रयोगशाला के उपकरण का उपयोग कर बगल में किया जाता है.
ठोस राज्य nanopores ऐसे न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के रूप में 1 एकल biomolecules के लक्षण वर्णन के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में उभरा है. हालांकि, एक पतली इन्सुलेट झिल्ली में एक nanopore की रचना चुनौती बनी हुई है. विशेष केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम सिस्टम से जुड़े निर्माण विधियों अच्छी तरह से परिभाषित nanopores उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध झिल्ली में विश्वसनीय और कम शोर nanopores की उपज 2,3 कम रहता है और आकार नियंत्रण 4,5 nontrivial है. यहाँ, ठीक धुन करने के लिए उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन इष्टतम कम शोर प्रदर्शन सुनिश्चित करते हुए nanopore के आकार का प्रदर्शन किया है. उच्च बिजली के क्षेत्र की ये कम दालों एक प्राचीन बिजली के संकेत उत्पादन और लंबे समय तक निवेश पर subnanometer परिशुद्धता के साथ nanopores के विस्तार के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है. इस विधि है की उपज और reproducibility में सुधार, मानक प्रयोगशाला के उपकरण का उपयोग कर एक जलीय वातावरण में बगल में किया जाता हैबदबूदार राज्य nanopore निर्माण.
जैविक और ठोस राज्य nanopores एक अणु स्तर 1 में Biomolecular analytes संवेदन का एक साधन प्रदान करते हैं. व्यक्तिगत nanopores आम तौर पर दो तरल जलाशयों के बीच पारित करने के लिए ईओण वर्तमान के लिए ही नाली प्रदान करने, पतली इन्सुलेट झिल्ली में एम्बेडेड रहे हैं. बड़े पैमाने पर कल्टर काउंटर के सिद्धांतों का उपयोग, nanopore प्रयोगों वे electrophoretically एक बाहरी बिजली क्षेत्र की उपस्थिति में एक nanopore के माध्यम से संचालित कर रहे हैं के रूप में वसूल biomolecules की लंबाई, आकार, प्रभारी और रचना का निर्धारण करने के लिए ईओण वर्तमान में परिवर्तन से संबंधित हैं.
ऐसे α-hemolysin रूप में जैविक nanopores आम तौर पर अधिक से अधिक संवेदनशीलता और कम शोर गुण 3 की पेशकश करते हैं, का समर्थन लिपिड bilayer उनकी प्रयोज्यता सीमित, नाजुक और निश्चित आकार की है. ठोस राज्य nanopores, दूसरी ओर, पतली (10-50 एनएम) सिलिकॉन नाइट्राइड या सिलिकॉन ऑक्साइड झिल्ली में निर्मित कर रहे हैं और विभिन्न siz का बनाया जा सकता हैतों, आसानी वेफर पैमाने टेक्नोलॉजीज 6,7 के साथ एकीकृत, और अधिक मजबूत कर रहे हैं, प्रयोगात्मक स्थितियों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुमति हो. इन फायदों के बावजूद, ठोस राज्य nanopore टेक्नोलॉजीज biomolecular पढ़ाई के लिए उनकी उपयोगिता है कि सीमा कई व्यावहारिक कमियों से ग्रस्त हैं. Nanopore आकार के नियंत्रण संभव है, यह विशेष उपकरणों और कुशल कर्मियों की जरूरत पड़ेगी, प्राप्त करने के लिए आमतौर पर महंगी और श्रमसाध्य है. उदाहरण के लिए, ध्यान केंद्रित आयन बीम द्वारा drilled nanopores हाल ही में एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) 5 में विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के तहत हटना करने के लिए दिखाया गया है. दूसरे दृष्टिकोण में, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) द्वारा drilled nanopores बीम की स्थिति और जलीय सॉल्वैंट्स 8 के लिए बाद में जोखिम के आधार पर विस्तार या सिकुड़ कर सकते हैं. Nanopore के आकार रासायनिक उपचार के बाद बदल सकते हैं या कर सकते हैं के रूप में इन मामलों में, nanopore आकार के प्राप्त सीमा, सीमित नियंत्रण के लिए मुश्किल और भी अविश्वसनीय हैएक विशेष तरल वातावरण 9 में डूबे हैं.
ठोस राज्य nanopores के माध्यम से आयनिक वर्तमान में भी उच्च शोर से ग्रस्त कर सकते हैं, जिनमें से सूत्रों nanopore साहित्य 2,3,10,11 में एक तीव्रता से जांच की विषय हैं. विभिन्न तरीकों बिजली के शोर को कम करने के लिए प्रस्तावित किया गया है, विश्वसनीय, स्थिर कम शोर nanopores की उपज आम तौर पर कम है. ड्रिलिंग और इमेजिंग के दौरान कारबोनकेयस अवशेषों का बयान अक्सर पूरा गीला एक चुनौती बना रही है और 12 को हटाने के लिए मुश्किल हो सकता है कि nanobubbles के गठन के कारण, बिजली के संकेत गुणवत्ता पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है. इसके अलावा, analyte अणुओं से nanopore के clogging संकेत गुणवत्ता प्रतिपादन आगे प्रयोग 13,14 के लिए व्यर्थ pores degrades. कुल मिलाकर, इन प्रभावों को बहुत कार्यात्मक nanopore उपकरणों की उपज को कम करने और ठोस राज्य nanopore अनुसंधान के साथ जुड़े लागत में वृद्धि.
आवेदन0.15-0.3 वी / एनएम की सीमा में उच्च बिजली क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए एजी / AgCl इलेक्ट्रोड के साथ एक वोल्टेज की tion इन चुनौतियों के लिए एक आश्चर्यजनक सरल समाधान प्रस्तुत करता है. कम वोल्टेज दालों, एकल अणु के अध्ययन के लिए एक स्वच्छ, कम शोर nanopore सतह आदर्श की चक्रीय आवेदन के माध्यम से उत्पादन किया जाता है. उच्च बिजली क्षेत्र के लिए दीर्घ विवरण nanopore व्यास में वृद्धि के परिणामस्वरूप ताकना दीवार गठन झिल्ली सामग्री को हटाने शुरू की. इस विकास ठीक नाड़ी शक्ति और अवधि ट्यूनिंग द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. अणुओं nanopore सतह को सोखना के रूप में वर्तमान निशान के कारण nanopore के clogging के लिए एक प्रयोग के दौरान अधिक नीचा के रूप में, इस प्रक्रिया अन्यथा खारिज कर दिया गया होता कि भरा उपकरणों को ठीक करने के लिए दोहराया जा सकता है. जैसे, कार्यात्मक nanopores की उपज आगे ही डिवाइस कई बार उपयोग करने की क्षमता की वृद्धि हुई है. यह तेजी से प्रयोगात्मक तहत तरल में किया जाता है के रूप में इस विधि के कई लाभ प्रदान करता हैशर्तों, केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित किया जा सकता है, और 95% से अधिक की उपज के साथ कार्यात्मक उच्च गुणवत्ता nanopores पैदा करता है.
Nanopore आकार के नियंत्रण biomolecular संवेदन अनुप्रयोगों में बुनियादी महत्व की है. Nanopore व्यास की जांच की जा रही अणुओं के आकार के आदेश पर होना चाहिए, वे नमूना समायोजित करने के लिए काफी बड़ी है, लेकिन इष्टतम संकेत करने वाली शोर हासिल करने के लिए काफी छोटा होना चाहिए. आकार के नियंत्रण उच्च बिजली क्षेत्र लागू करने की प्रस्तुत विधि का उपयोग करते हुए कि nanopore व्यास में दिशाहीन है केवल प्रक्रिया भर में बढ़ रहे हैं, 3-100 एनएम के बीच व्यास के साथ nanopores subnanometer परिशुद्धता के साथ, फैशन हो सकता है. 3-4 एनएम pores आसानी से एक मंदिर में 23 का उपयोग कर गढ़े जा सकते हैं, इस भारी प्रोटीन ligand परिसरों की बातचीत के लिए ssDNA संरचना की जांच कर से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ठोस राज्य nanopores के विश्वसनीय निर्माण के लिए अनुमति देता है. 100 एनएम ऊपर nanopore विकास बहुत तेजी से और कम सटीक हो सकता है, और अधिक उदार विस्तार शर्तों प्रक्रिया पर बेहतर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जा सकता. एस के रूप मेंuch, प्रभावी आकार नियंत्रण प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम विस्तार दक्षता और एक वांछित ताकना व्यास को प्राप्त करने में आवश्यक परिशुद्धता के स्तर को संतुलित करने के क्रम में नाड़ी शक्ति और अवधि की पसंद है. यह आगे बढ़ने को एक कम पूर्वाग्रह लेकिन तुलनीय बिजली क्षेत्र शक्ति मनाया जाता है जहां पतले nanopores (10 एनएम मोटाई), की वृद्धि से प्रकाश डाला है. अंतिम आकार पर निर्भर करता है, यह कुछ ही मिनटों में उप 100 एनएम व्यास को एक nanopore विस्तार करने के लिए आम तौर पर संभव है.
यह पृष्ठभूमि शोर से स्थानान्तरण संकेतों को अलग करने के लिए लगभग असंभव है के रूप में इसी तरह, बड़े कम आवृत्ति मौजूदा उतार चढ़ाव के एकल अणु पढ़ाई में बाधा. अधूरा 24 गीला, प्रारंभिक निर्माण 25 और nanopore दीवार 13 पर मलबे की सोखना के बाद शेष कारबोनकेयस अवशेषों की उपस्थिति अक्सर मैं हैं कि कठोर रासायनिक उपचार के साथ अतिरिक्त सफाई की आवश्यकता होती है, संकेत गुणवत्ता नीचा कर सकते हैंnefficacious. ठोस राज्य nanopore प्रोटोकॉल गीला सहायता या ड्रिलिंग, इमेजिंग और हैंडलिंग प्रक्रियाओं से बचे किसी भी संक्रमण को दूर करने के लिए बढ़ते से पहले पिरान्हा समाधान में या ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ nanopore सफाई के महत्व पर जोर करने के लिए दिलचस्प है, यह आम बात है. यहां तक कि इस उपचार के साथ, तथापि, nanopores अक्सर गीला नहीं करते या उच्च शोर प्रदर्शन जारी है, और असफल प्रयास के लिए सुझाव दिया समाधान अत्यंत समय 14 लगता हो सकता है जो अतिरिक्त सफाई प्रदर्शन करने के लिए है. उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन के साथ, इन लंबा प्रोटोकॉल आवेदन के आधार पर आवश्यक हो सकता है. यह सबसे उपकरणों फलस्वरूप तैयारी के समय और कठोर रसायनों से निपटने के लिए जरूरत को कम करने, इस के साथ साथ वर्णित विधि का उपयोग बगल में उसकी मरम्मत की जा सकती है कि पाया गया था. बिजली के शोर को कम करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम पूरी तरह से ध्यान में लीन होना गीला और शिथिल बाध्य मलबा हटाने के लिए वोल्टेज और / या नाड़ी की अवधि में एक साधारण वृद्धि हुई है.इस फैशन में इलाज Nanopores मज़बूती से इस तरह के डीएनए और प्रोटीन के पारित होने के रूप में बायोमोलिक्यूल स्थानान्तरण प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है. इन अणुओं एक भरा और शोर बिजली के संकेत के लिए अग्रणी ताकना दीवार का पालन करना है, तो उच्च बिजली क्षेत्र दालों बाधा हटाने और fluidic सेल से nanopore चिप की unmounting बिना आगे प्रयोग के लिए कम शोर गुण हासिल करने के लिए लागू की जा सके.
वर्णित सेटअप का उपयोग उच्च बिजली क्षेत्र के आवेदन के लिए उच्च बैंडविड्थ (> 1 kHz) पर संवेदनशीलता और कम शोर गुणों की कमी है जो 10 वी और वर्तमान एम्पलीफायर, अप करने के लिए आवेदन कर सकते हैं कि एक बाहरी बिजली की आपूर्ति की आवश्यकता द्वारा सीमित है एक अणु संवेदन. ठेठ biomolecular प्रयोगों ± 1 वी तक सीमित है कि एक कम शोर वर्तमान एम्पलीफायर पर भरोसा करते हैं, यह एक adju साथ उच्च बिजली के क्षेत्र कंडीशनिंग और संवेदनशील वर्तमान माप दोनों हासिल कर सकते हैं कि एक एकल प्रणाली डिजाइन करने के लिए सरल हैस्थिर लाभ. इस सीमा के बावजूद, दूसरे के लिए एक सेटअप से संक्रमण त्वरित और सरल है. ऐसे SEM 5, थर्मल ऑक्सीकरण और 8 देगी झिल्ली के उपयोग के रूप nanopore आकार को नियंत्रित करने के लिए मौजूदा तकनीक के साथ इसकी तुलना में, उच्च बिजली क्षेत्र मानक उपकरण का उपयोग कर प्रयोगशाला बेंच पर प्रदर्शन किया और प्रदान की जा सकती है कि एक तेज, और अधिक सटीक और कम खर्चीला कार्यप्रणाली की पेशकश nanopore आकार की एक व्यापक रेंज. तेजी से और reproducibly कम आवृत्ति शोर को कम करने की क्षमता भी प्रारंभिक निर्माण अधिक विश्वसनीय बनाता है और पहले से इस्तेमाल किया है pores आगे के प्रयोगों के लिए भी दोबारा से किया जा सकता है, के रूप में ठोस राज्य nanopores के जीवनकाल को बढ़ाता है. कुल मिलाकर, उच्च बिजली क्षेत्र के साथ वातानुकूलित अलग मोटाई की nanopores के 95% से अधिक बायोमोलिक्यूल संवेदन के लिए उपयुक्त उन्हें प्रतिपादन, बहुत कम कम आवृत्ति शोर विशेषता प्रदर्शन किया. निर्माण ठोस राज्य nanopore प्रयोगों अधिक accessi, जिससे इस प्रकार तेजी से और अधिक विश्वसनीय हैशोधकर्ताओं के ble और संभवतः अधिक मजबूत निर्माण प्रक्रियाओं के माध्यम से nanopore प्रौद्योगिकियों के व्यावसायीकरण की दिशा में एक पथ के लिए अनुमति देता है.
The authors have nothing to disclose.
हम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन, और ओंटारियो रिसर्च फंड के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल द्वारा समर्थन को स्वीकार करते हैं. हम nanopore सॉफ्टवेयर और इंस्ट्रूमेंटेशन डिजाइन के साथ मदद के लिए बहुमूल्य विचार विमर्श और तकनीकी समर्थन के लिए nanopore निर्माण और लक्षण, एल Andrzejewski में सहायता के लिए वाई लियू धन्यवाद, और ए Marziali.
JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
Hot plate | VWR | Heating piranha solution |